神經細胞的分散培養

一． 設備： 無菌操作設備。

二． 大型設備：

CO2培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。

倒置顯微鏡：用于每天觀察貼壁細胞生長情況。

解剖顯微鏡，用于準確地取材。

常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。

低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。

電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。

高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術器械。

過濾器：配制解剖液、培養液，必須過濾后才可使用，以去除細菌。

滲透壓儀，pH劑，天平等。

易生物儀器庫：http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html

三． 培養器皿及手術器械

1 培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。

2 培養板，24-40孔，可用于開放培養。

3 培養瓶。

4 吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。

5各類培養液貯存器。

6 小型手術器械。

準備：

一 配制培養液

（1） 解剖液：以無機鹽（去除Ca2+, Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。

（2） 基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。
（3） 接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。

（4） 維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營養物質。

二 培養基質 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴氨酸，再涂膠

三 消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗 2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進行。

神經細胞分散培養

（一） 選材 常用胚胎動物或新生鼠神經組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過也有認為與組織相關。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質聯合培養的大鼠胚，則黑質以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經成活率高。

（二） 取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。

（三） 細胞分離與接種。神經組織用 0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。

（四） 抑制膠質細胞生長。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經膠質細胞的生長。

（五） 觀察。接種6-12h，開始貼壁，并有集合現象，細胞生長突起明顯，5-7d膠質細胞增生明顯，7-10d膠質細胞成片于神經細胞下面，形成地毯，2周時神經細胞生長最豐滿，四周暈光明顯，一個月后，有些神經細胞開始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周最宜。

但神經細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會有細胞周期，而且隨培養時間的延長，細胞數量在下降，但膠質細胞可以，神經膠質細胞也可以。在培養過程中，早期9-12d時，有較多的神經細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長而多，且相互形成突觸。

（六） 常用培養細胞實驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；

但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時，首先考慮膜對抗體的通透性問題。常用化學試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。

在免疫組化中，或其它組織學染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹突膠質細胞標記明顯；GFAP對星形膠質細胞具有特異性染色等。這對研究神經系統中膠質細胞功能具有極大的應用價值。神經膠質細胞以往多被忽視，其在腦血管疾病（如缺血性損傷）、退行性疾病（如AD、 PD）、損傷后膠質細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經細胞功能和營養支持的物質基礎。