離子交換層析法分離氨基酸

實驗概要

本實驗介紹了離子交換柱層析法的基本操作技術，采用離子交換樹脂分離了氨基酸。

實驗原理

離子交換層析法主要是根據物質的解離性質的差異而選用不同的離子交換劑進行分離的方法。各種氨基酸分子的結構不同，在同一pH時與離子交換樹脂的親和力有差異，因此可依據親和力從小到大的順序被洗脫液洗脫下來，達到分離的效果。

主要試劑

苯乙烯磺酸鈉型樹脂(強酸1×8，100—200目)；2mol/L鹽酸溶液；2mol/L氫氧化鈉溶液。

標準氨基酸溶液：天冬氨酸、賴氨酸和組氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L的鹽酸溶液。

混合氨基酸溶液：將3種標準氨基酸溶液按1∶2.5∶10的比例混合。

檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液(pH5.8，鈉離子濃度0.45mol/L)：取檸檬酸(C₆O₇H₈.H₂O)14.25g，氫氧化鈉9.30g和濃鹽酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存。

顯色劑：2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇單甲醚中，加水至100mL。

主要設備

20cm×1cm層析管；恒壓洗脫瓶；部分收集器；分光光度計。

實驗步驟

1. 樹脂的處理

將干的強酸型樹脂用蒸餾水浸泡過夜，使之充分溶脹。用4倍體積的2mol/L的鹽酸浸泡1小時，傾去清液，洗至中性。再用2mol/L的氫氧化鈉處理，做法同上。最后用欲使用的緩沖液浸泡。

2. 裝柱

取直徑1cm，長度10-12cm的層析柱。將柱垂直至于鐵架上。自頂部注入上述經處理的樹脂懸浮液，關閉層析柱出口，待樹脂沉降后，放出過量溶液，再加入一些樹脂，至樹脂沉降至8-10cm的高度即可。

3. 氨基酸的洗脫

用pH5.8的檸檬酸緩沖液沖洗平衡交換柱。調節流速為0.5mL/min，流出液達到床體積的4倍時即可上樣。由柱上端仔細加入氨基酸的混合液0.25—0.5mL，同時開始收集流出液。當樣品液彎月面靠近樹脂頂端時，即刻加入0.5mL檸檬酸緩沖液沖洗加樣品處。待緩沖液彎月面靠近樹脂頂端時，再加入0.5mL緩沖液。如此重復兩次，然后用滴管小心注入檸檬酸緩沖液(切勿攪動床面)，并將柱與洗脫瓶和部分收集器相連。開始用試管收集洗脫液，每管收集1mL，共收集60—80管。

4. 氨基酸的鑒定

向各管收集液中加1mL水合茚三酮顯色劑并混勻，在沸水浴中準確加熱15min后冷卻至室溫，再加入1.5mL的50%乙醇溶液。放置10分鐘。以收集液第2管為空白，測定A570波長的光吸收值，以光吸收值為縱坐標，以洗脫液體積為橫坐標繪制洗脫曲線。以已知3種氨基酸的純溶液樣品，按上述方法和條件分別操作，將得到的洗脫液曲線與混合氨基酸的洗脫曲線對照，可確定3個峰的大致位置及各峰為何種氨基酸。