科研新發現為開發新型阿片類鎮痛藥“鋪路”

圖為一個盛開著罌粟花的大腦，罌粟是阿片類鎮痛藥的重要來源。罌粟花上有一只青蛙，表示本研究中使用了來自青蛙皮膚表面的皮啡肽。圖像右側是四個被激活的阿片受體的結構被嵌在細胞膜內。來自罌粟中的阿片物質模擬了人體內的阿片肽功能，均通過結合阿片受體來調控人體內鎮痛、感知、獎賞等生理活動。本研究報道了整個阿片受體家族結合內源性多肽，以及DOR和青蛙皮膚表面的外源皮啡肽的三維結構。

內源阿片系統由四個阿片受體成員以及一系列阿片肽組成，廣泛分布在中樞神經系統、外周神經系統和免疫系統中，調控鎮痛、欣快、獎賞、認知、應激等信號通路，是臨床用于治療疼痛、焦慮等疾病的重要靶標。

阿片受體家族共有四個成員，分別為μOR、δOR、κOR、NOPR，均屬于G蛋白偶聯受體，主要通過偶聯下游Gi蛋白發揮功能。阿片受體不僅會被體內產生的阿片肽激活，也會被外源的阿片類/非阿片類藥物激活，包括廣為人知的嗎啡、芬太尼等藥物。在2022年11月10號的Cell期刊上，徐華強研究員/莊友文副研究員團隊聯合謝欣研究員團隊、王明偉教授團隊，首次報道了嗎啡和芬太尼結合人源μOR-Gi蛋白信號復合體的結構，揭示了兩者在結合μ型阿片受體上的關鍵差異因素。

靶向μOR的小分子阿片藥物廣泛用于臨床中至重度的急性疼痛，然而它們在強效鎮痛的同時也伴隨著耐藥、呼吸抑制、成癮等諸多嚴重的副作用。為了開發更低毒副作用的鎮痛類藥物，科研人員將目光聚焦到了其它亞型阿片受體的激動劑上，成功促進了一些鎮痛藥物的研發，包括靶向κOR的地佐辛、鹽酸噴他佐辛酯、納布啡癸二酸，氫溴酸依他佐辛等上市藥物，靶向δOR的SRI-22138、BMS986187等臨床在研藥物，靶向NOPR的PPL-138、LY-2940094等臨床在研藥物（源于藥渡數據）。盡管有了很大的進展，由于小分子藥物較差的選擇性和藥理活性，還是引發了其他副作用：致幻、驚厥、癲癇等，導致它們的臨床進展受到了阻礙、甚至被終止。

人體中的阿片肽不僅是強效鎮痛藥嗎啡等外源阿片藥物的天然模板，而且在機體自身分泌的濃度下不導致成癮、呼吸抑制等副作用，內源性的阿片肽對四種阿片受體具有很高的親和力以及激動活性，最重要的是具有高度選擇性，這些特性賦予了它們重要的研發價值。近幾年隨著那句“少年只知多巴胺，中年才懂內啡肽”網絡名言的廣為流傳，刺激內啡肽生成的勵志活動被逐漸推廣。內啡肽是阿片肽眾多成員中的一種多肽神經遞質，它會在身體感到疼痛或者有壓力時被釋放，有助于減輕疼痛、緩解壓力，內啡肽也會在按摩、跑步、游泳等鍛煉運動中被釋放，通過機體的獎賞信號通路來提升人的幸福感。阿片肽由一系列前體蛋白經過酶解和修飾得到，包括內啡肽、強啡肽、腦啡肽和痛敏肽等。除了內源性的阿片肽以外，阿片受體也會被外源的多肽激活，包括食物中的酪啡肽、青蛙皮膚表面的皮啡肽等。

隨著X-射線晶體技術和冷凍電鏡技術的發展，在近20年間，已經有超過800個GPCR相關的結構被報道（源于GPCRdb），阿片受體作為舉足輕重的一類藥物靶標，該家族的失活和激活結構也被相繼發表，在之前的研究中，很多備受關注的科學問題得以解釋，包括阿片受體與小分子拮抗劑/激動劑的結合模式，鈉離子口袋介導的激活機制，μOR的偏向性機制等。然而，內源性阿片肽配體如何選擇性識別并激活不同亞型阿片受體的分子機制尚不清楚，阻礙了科研人員對阿片肽的認知與合理的設計改造。

2023年1月12日，中國科學院上海藥物研究所徐華強/莊友文團隊聯合美國北卡羅萊納大學教堂山分校Bryan L. Roth團隊合作在國際頂級期刊Cell上以長文形式在線發表了題為“Structures of the entire human opioid receptor family”的研究論文。該項研究系統地分析和明確了各內源性阿片肽對阿片受體的信號活性，并進一步解析了阿片受體家族四個亞型μOR、δOR、κOR、NOPR和各自的選擇性阿片肽包括內啡肽、內嗎啡肽、強啡肽、皮啡肽和痛敏肽的冷凍電鏡復合物結構，結合大量細胞水平的功能實驗，揭示了多肽類配體和阿片受體的結合模式，闡述了它們的選擇性和保守性機制，為“信使-信箱-效能”模式提供了結構和功能支持。

在本項研究中，研究人員首先通過細胞水平的功能實驗，較為系統地分析了阿片肽對野生型阿片受體的的信號傳導特性。由于內啡肽和腦啡肽對μOR、δOR的激活程度相近，為了系統地闡述選擇性差異，研究人員最終鎖定了內啡肽以及選擇性更顯著的內嗎啡肽、強啡肽、痛敏肽和外源的皮啡肽作為研究對象，分別解析了內啡肽-μOR、內嗎啡肽-μOR、強啡肽-κOR、痛敏肽-NOPR，皮啡肽-δOR的高分辨率冷凍電鏡三維結構，并用第二信使cAMP的抑制試驗、G蛋白和arrestin蛋白的招募實驗來分析突變體的特性。

圖1. 阿片受體結合阿片肽的功能實驗和冷凍電鏡結構。A：阿片肽誘導阿片受體激活的親和力，B：cAMP抑制曲線結果，C：Gi招募實驗的曲線結果，D-H：阿片受體結合阿片肽的冷凍電鏡結構和原子模型。

研究發現，所有的阿片肽都是以N端插入的方式進入受體，阿片肽的N端基序YGGF（痛敏肽是FGGF）“信使”結合在阿片受體極為保守的正構結合口袋腔室里，第一個酪氨酸/苯丙氨酸主鏈上的胺基均與D3.32Q2.60Y7.43基序形成極性網絡，該保守腔室對配體的識別和藥理活性是必不可少的，合成的YGGF四肽便可以通過較弱的作用激活四個受體（EC50約10μM）。結構分析發現，阿片受體的胞外端，主要為ECL2/3以及TM2/6/7的胞外端在序列和帶電性上都具有差異性，比如κOR和NOPR的ECL2富含帶負電的氨基酸，對應的強啡肽和痛敏肽在ECL2處富含帶正電的氨基酸。大規模功能突變實驗結果表明，阿片受體ECL2/3和TM2/6/7的胞外端序列不保守性和帶電差異性共同決定著阿片受體對阿片肽的選擇性結合。

NOPR是阿片受體家族中最后一個被發現的受體，沒有被冠以希臘字母名稱，本研究解析的痛敏肽結合NOPR的結構，也是首個激活形式NOPR的結構，通過結構比對分析，不出意外地發現它遵循阿片受體通用的激活機制。除此之外，阿片受體對于下游Gi蛋白有著極高的選擇性，本研究發現阿片受體的ICL3會形成一個短的α螺旋與Gi形成疏水作用，同時保守的精氨酸與Gi形成靜電作用。這也可以部分解釋Gi結合的GPCR結構都含有完整的ICL3，而與其他亞型G蛋白（Gs，Gq）結合的GPCR結構中往往缺失了ICL3的電子云密度的原因。

綜上所述，研究團隊通過解析阿片肽結合的阿片受體結構，系統地闡釋了多肽配體的結合模式，揭示了阿片受體中保守的結合口袋以及獨特的ECL2/3共同介導阿片肽的作用機制，闡明了阿片受體通用的激活機制以及對下游Gi蛋白的選擇性特征。這些工作為理解阿片系統的生物學特性提供了夯實的結構基礎，為設計新型高效的阿片肽類鎮痛藥物鋪平了道路。

圖2. 阿片受體和阿片肽的選擇以及“信使-信箱”概念的結構基礎。

本研究冷凍電鏡數據在上海藥物所高峰電鏡中心和上海藥物所冷凍電鏡平臺收集。中國科學院上海藥物所博士研究生王悅、副研究員莊友文、北卡羅來納大學教堂山分校Jeffery F. DiBerto為該論文的共同第一作者。上海藥物所徐華強研究員、莊友文副研究員，以及北卡羅來納大學教堂山分校Bryan L. Roth教授為論文的共同通訊作者。參與本次研究的還有上海藥物所碩士畢業生劉衛一、高峰電鏡中心執行主任袁青寧，美國溫安洛研究所Karsten Melcher教授和X. Edward Zhou博士等。該工作獲得了國家自然科學基金委、科技部重點研發計劃、上海市科技重大專項、中科院特別助理研究項目以及美國國立心理健康研究院、國立衛生研究院等的項目經費資助。