等電聚焦電泳法測定蛋白質的等電點

丙烯酰胺 甲叉雙丙烯酰胺 兩性電解質 Ampholine 過硫酸胺 TEMED 磷酸 NaOH 三氯乙酸

電泳儀 垂直管式園盤電泳槽一套 注射器與針頭 移液管 小燒杯若干 培養皿 直尺 小刀 精密 pH 試紙和帶細長復合 pH 電極的 pH 計 塑料薄膜和橡皮筋

儀器和用具

1. 電泳儀

2. 垂直管式園盤電泳槽一套

3. 注射器與針頭

4. 移液管：10 ml、5 ml、2 ml、1 ml、0.1 ml

5. 小燒杯若干

6. 培養皿一套

7. 直尺

8. 小刀

9. 精密 pH 試紙和帶細長復合 pH 電極的 pH 計

10. 塑料薄膜和橡皮筋

試劑

1. 丙烯酰胺

2. 甲叉雙丙烯酰胺

3. 兩性電解質 Ampholine（40%，pH3.5~9.5）

4. 過硫酸胺（催化劑）

5.  TEMED（四甲基乙二胺）（加速劑）

6. 磷酸

7.  NaOH

8. 三氯乙酸（TCA）

溶液配制

1. 丙烯酰胺貯液（30% 丙烯酰胺，交聯度 2.6%）：，30 g 丙烯酰胺和 0.8 g 甲叉雙丙烯酰胺溶于 H₂O，定容至 100 ml，濾去不溶物后存于棕色瓶，4℃ 可保存數月。（全班公用）（另一配方為 29.1 g 丙烯酰胺和 0.9 g 甲叉雙丙烯酰胺溶于 H₂O，定容至 100 ml，交聯度為 3.0%）。

2. 兩性電解質 Amphline（40%）的加入量為：50ml /ml 膠液。

3. 過硫酸胺：配成 1 mg/ml 的濃度，當天配制，配 100 ml 全班公用。膠液中的加入量為 0.5 mg/ml 膠液。

4.  TEMED：膠液中的加入量為 1ul/ml 膠液。

5. 蛋白質樣品：選用兩種等電點相差較大的蛋白質，每根垂直管中每種蛋白質的加樣量控制在<100ug。蛋白質樣品配制成各為 5 mg/ml 的濃度。配 2.5 ml 全班公用。

6. 固定液：10% 的三氯乙酸，每組配 50 ml。

7. 陽極電極液：0.1M H₃PO₄

3.4 ml 濃磷酸（85%）加 H₂O 至 500 ml，每個電泳槽用 500 ml。

8. 陰極電極液：0.5M NaOH

2 g NaOH 加 H₂O 溶解至 500 ml，每個電泳槽用 500 ml。

操作步驟

1. 配膠




過硫酸銨是膠聚合的催化劑，因此最后加入，加畢，立即搖勻，因膠很快就會聚合，必須立即裝管。通常化學聚合的膠液，需在過硫酸銨加入前進行減壓抽氣處理，本實驗將此抽氣步驟省略并不影響實驗結果。

2. 裝管

每個學生裝兩支管，每組裝四支。先用肥皂洗手，然后將圓盤電泳槽的玻璃管洗凈，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在試管架上，用移液管將配好的膠液移入管內，（每根玻璃管的容量約為 1.5~1.8 ml）, 液面加至距管口 1 mm 處，用注射器輕輕加入少許 H₂O，進行水封，以消除彎月面使膠柱頂端平坦。膠管垂直聚合約 30 分鐘，聚合完成時可觀察到水封下的折光面。

3. 裝槽和電泳

用濾紙條吸去膠管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，將膠管垂直插入圓盤電泳槽內，調節好各管的高度，記下管號。每支管約 1/3 在上槽，2/3 在下槽。上槽加入 500 ml 0.1M H₃PO₄，下槽加入 500 ml 0.1M NaOH，淹沒各管口和電極，用注射器或滴管吸去管口的氣泡。上槽接正極，下槽接負極，開啟電泳儀，恒壓 160V，聚焦 2 至 3 小時，至電流近于零不再降低時，停止電泳。

4. 剝膠

取下膠管，用 H₂O 將膠管和兩端洗 2 次，用注射器沿管壁輕輕插入針頭，在轉動膠管和內插針頭的同時分別向膠管兩端注入 H2O 少許，膠條即自行滑出，若不滑出可用洗耳球輕輕擠出。膠條置于小培養皿內，記住正極端為"頭"，負極端為"尾"，若分不清時，可用 pH 試紙鑒定，酸性端為正，堿性端為負。

5. 固定

取 2 支膠條置于一個小培養皿內，倒入 10% 三氯乙酸溶液至沒過膠條，進行固定，約半小時后，即可看到膠條內蛋白質的白色沉淀帶。固定完畢，倒出固定液，用直尺量出膠條長度"L2"和正極端到蛋白質白色沉淀帶中心（即聚焦部位）的長度"L"。

固定后的膠條可在康強 860 紫外/可見分光光度計上用 280nm 或 238nm 波長作凝膠掃描，然后用掃描圖作相應的測量和計算。

6. 測定 pH 梯度

將放在另一個培養皿內未固定的膠條，用直尺量出待測 pH 膠條的長度"L1"。按照由正極至負極的順序，用鑷子和小刀依次將膠條切成 10 mm 長的小段，分別置于小試管中，加入 1 ml H₂O，浸泡半小時以上或過夜，用仔細校正后的帶細長 pH 復合電極的 pH 計測出每管浸出液的 pH 值。

數據處理

1. 以膠條長度（mm）為橫座標，pH 值為縱座標作圖，得到一條 pH 梯度曲線。所測每管的 pH 值為 10 mm 膠條的 pH 的混合平均值。作圖時將此 pH 值取為 10 mm 小段中心即 5 mm 處的 pH 值。

2. 用下式計算蛋白質聚焦部位至膠條正極端的實際長度 L ：



上式中：  L'--量出蛋白質的白色沉淀帶中心至膠條正極端的長度。

L₁--測 pH 的膠條的長度

L₂--固定后膠條的長度

3. 根據計算出的 L，由 pH 梯度曲線上查出相應的 pH 值，即為該蛋白質的等電點。

4. 畫出固定后所測膠條的示意圖。

附注

1. 對兩性電解質的要求

兩性電解質是等電聚焦的關鍵試劑，所以對兩性電解質的質和量都要特別注意。兩性電解質含量以 2%～3% 較適合，能形成好的 pH 梯度。由于載體兩性電解質是由多乙烯多胺與丙烯酸進行加成反應生成的混合物，防止時間過長會分菌，分解變質，不能使用。

2. 指教注意的問題

（1）丙烯酰胺最好是重結晶的。

（2）過硫酸銨一定要新配制。

（3）所有水要用雙蒸水。

（4）制膠時，玻璃板和模板必須水平放置。

（5）模板要平直光滑，不然灌膠時易濺漏。

3、防止燒膠

（1）平板等點聚焦電泳的膠很薄（0.6 mm），當問柳在 8mA 時，電壓可上升到 550V 以上，由于陰極飄移，造成局部電流過大，膠承受不了而被燒斷。

（2）防止燒膠的辦法：注意觀察，穩流 8mA，電壓上升到 550V 時，立即關電源。用恒功率電泳儀，控制輸出功率在指定范圍。在一定功率范圍內，改進冷卻條件，使因電流產生的熱量及時散去。

（3）如果膠被燒了，可在燒斷的位置換上一條寬的電極條壓過斷縫或在電源電極條內側加一電極條，以此補救。

4. 攪拌制作注意事項

固定液可使蛋白質變性，不再擴散，故一定要多換一次；在電泳后取膠、固定、染色直至制干膠板都必須仔細，防止膠被損壞。