脈沖場凝膠電泳實驗

實驗概要

了解脈沖場凝膠電泳（PFGE）的工作原理，并學習和掌握有關的操作技術。

實驗原理

大分子DNA(一般長度超過20kb，在某些情況下，超過40kb)在電場作用下通過孔徑小于分子大小的凝膠時，將會改變無規卷曲的構象，沿電場方向伸直，與電場平行從而才能通過凝膠。此時，大分子通過凝膠的方式相同，遷移率無差別(也稱“極限遷移率”)，不能分離。脈沖場凝膠電泳技術解決了這一難題，它應用于分離純化大小在10～2000kb  之間的DNA  片段。這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間顯著地依賴于分子大小，DNA  越大，這種構象改變需要的時間越長，重新定向的時間也越長，于是在每個脈沖時間內可用于新方向泳動的時間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA  移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。在許多實用的PFGE  方法中，倒轉電場凝膠電泳是最簡單最常用的方法(FIGE)。通過把一個在不同電場方向有不同脈沖方式的脈沖電場加在樣品上，倒轉電場凝膠電泳(FIGE)設備能把大小范圍在10～2000kb  的DNA 片段分開。FIGE也可通過重新確定一個對準完全固定好角度的電場，這樣會進一步擴展其分離極限達到10Mb。

主要試劑

1. 制備DNA樣品所需材料：

   1) TEN 緩沖液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA)。

   2) Seaplaque 瓊脂糖(EC 緩沖液中濃度為2%)。

   3) EC 緩沖液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5% Brij58；0.2%脫氧膽酸鹽(Deoxycholate)；0.5%十二烷基肌氨酸鈉(Sarcosyl)。

   4) ESP 緩沖液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸鈉，lmg/mL 蛋白酶K)。

   5) 溶葡萄球菌素(5mg/mL)。

   6) RNase(10mg/mL)。

   7) 膠模(由常規瓊脂糖凝膠制得或購買成品)。

   8) 苯甲基橫酰氟(PMSF)(17.4mg/mL于乙醇中)。

   9) 0.5μg/mL 溴化乙錠

2. 分離、純化大的DNA 片段所需材料：

   1) 紫外遞質。

   2) 10mg/mL tRNA。

   3) 5mol/L NaCl。

   4) 苯酚/氯仿。

   5) 3mol/L NaAc，pH5.2。

   6) 95%乙醇。

主要設備

1. Wide Mini-Sub Cell 凝膠電泳設備。

2. 變速泵或蠕動泵(Bio-Red Laboratory)。

3. IBI FIJI 600 HV 程序性開關設備。

4. 緩沖液冷卻循環器(Fotodyne ， New Britain ，WI) 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory)。

實驗步驟

1. 脈沖電場凝膠電泳的DNA樣品的制備：

為避免大分子DNA 在提取過程中斷裂，細胞需在瓊脂糖凝膠塊中進行原位裂解，在本實驗中，我們使用金黃色葡萄球菌(StapHylococcus aureus)作為例子。

   1) 取100mL 對數生長期金黃色葡萄球菌細胞于4℃，5000g 離心5min。

   2) 用20mL TEN 緩沖液沖洗沉淀，同樣條件離心5min。之后用10mL EC 緩沖液使細胞懸浮。

   3) 取1.5mL 細胞樣品與相同體積含2%SeaPLaque 瓊脂糖的EC 緩沖液迅速混合混勻并等分流溶液至封閉的模塊中于4℃凝固，混合前加熱至瓊脂糖熔解并冷卻至50℃。

   4) 對于每一個菌株，需要15～20 個凝膠塊，將它們放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase)的10mL EC 緩沖液中，于37℃振搖過夜。

   5) 去掉裂解緩沖液，換為10mL ESP 緩沖液于50℃輕度振搖溫育48h。

   6) 將凝膠塊放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF)的TE 緩沖液中，室溫溫育4h(2h 換液一次)，以滅活ESP 中的蛋白酶K。

   7) 用TE 清洗瓊脂塊6h(2h 換液一次)，置于TE 中4℃保存。

2. 限制酶消化：

提高PFGE 的分辨率取決于100～1000kb 片段電泳結果的重復率，它與酶切關系密切，可在瓊脂糖凝膠塊中使用合適的內切酶消化。

   1) 25μL10×反應緩沖液，30U 限制酶，加雙蒸水至250μL 混勻。

   2) 取一個凝膠塊置其中，合適溫度下溫育過夜(按內切酶要求)后，用TE 緩沖液洗滌并貯存。

3. 應用PFGE 對樣品DNA 進行分析：

   1) 用0.5×TBE 緩沖液制備一個0.8%SeakemHGT 瓊脂糖凝膠，膠的厚度盡量與樣品凝膠塊相符。若用Wide Minisub Cell 進行電泳的話，50mL該溶液即可。

   2) 膠凝后，小心移去樣品梳。將凝膠塊用小刀切成與加樣孔一致的大小，將樣心地插入加樣孔，避免產生氣泡。(若樣品在溶液中，以l:1 的比率與50℃2%Seaplaque 瓊脂糖相混合，迅速注入加樣孔中)。

   3) 把膠放入電泳槽內，加緩沖液，剛好覆蓋膠的表面即可，緩沖液事先14℃冷卻。

   4) 將電泳槽和一個連著穩壓電源的程序性開關設備相連。打開電源，調節蠕動泵到適當流速(5～10mL/rain)或打開變速泵至40。

   5) 通過計算機啟動極性轉換程序。大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的電脈沖下得以分離，時間一般為3.5h 或更長。小于50kb 的限制性片段在0.4s正向和0.2s 反向的電脈沖(比率為2:1)下得以分離，時間為3～5h。

   6) 在0.5μg/mL溴化乙錠中進行染色并拍照。

4. 分離、純化大的DNA片段：

   1) 凝膠染色、分析后，在目的帶前(靠近正極處)切一個6.25px²左右的槽，注入0.8%Seaplaque瓊脂糖，使之凝固。

   2) 重新打開極性轉換開關，用紫外遞質檢測DNA的遷移，當目的帶進入Seaplaque凝膠中時，關閉開關，切下目的帶，移至1.5mL EP管中。

   3) 加入2μL 的tRNA，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸餾水，在65～70℃之間，化膠并保溫10min。

   4) 苯酚/氯仿500μL 抽提兩次。

   5) 用2.5 倍體積95%乙醇和1/10 體積NaAc(3mol/L，pH5.2)于-70℃10min 沉淀水相。再用70%乙醇洗兩次并將沉淀溶于TE 緩沖液中。

注意事項

1. 換緩沖掖時盡可能小心不要碰壞瓊脂凝膠。

2. PMSF 是一個強烈的蛋白酶共價抑制劑，即有毒又揮發，操作時應在通風櫥中進行。

3. 用蛋白酶K 包埋的材料時50℃溫育時間很長(24～48h)，有些學者提出如此長時間不必要(Mortimer et al.1990)，且可能造成高分子質量DNA 降解。在實驗中可視情況而定。

4. 瓊脂糖凝膠塊在TE(pH7.6)中4℃可存放數年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更長時間。

5. 一些高壓電源并不適合脈沖電場凝膠電泳，因為這些電源設計時均帶有保護電路，它可以檢測到負載的突然降低并且引發外加電源自動關閉。

6. 由于電壓較高，就會產生熱量，為了保證溫度為14℃，需要一些冷卻設備(緩沖液冷卻循環器或MiniChiller)。此外，把電泳系統放在一個敞口的冰盒中也可保持恒溫。