蛋白的的原核表達及其對同源性感染的免疫保護性研究

實驗概要

用雞艾美爾球蟲的SO7基因與重組質粒pMG36t 結合，再把pMG36t-SO7導入到 E. coli χ13 體內，選擇陽性的E. coli χ13( pMG36t-SO7 )即： E. coli χ2，然后用它去免疫，分析免疫效果。

實驗原理

通過原核表達系統大腸桿菌來表達柔嫩艾美耳球蟲的一個抗原基因SO7，把純化出來的蛋白進行免疫，首免和二免后感染，觀察免疫效果。

主要試劑

T4DNA連接酶；限制性內切酶；質粒小提試劑盒；DNA膠回收試劑盒

主要設備

PCR儀；伯樂電泳儀；臺式高速冷凍離心機

實驗材料

雞：一日齡的SPF 雞。

球蟲：北京艾美耳球蟲強毒株。

細菌：胸苷酸酶基因突變以后形成的χ13型的大腸桿菌。

質粒：pMG36e重組質粒是由中國科學院微生物研究所提供的。

實驗步驟

1. 構建沒有抗藥基因的重組表達載體：pMG36t-SO7；
2. 陽性重組大腸桿菌的鑒定和構建的pMG36t-SO7的穩定性鑒定；
3. 用氯化鈣處理E. coli χ13 使pMG36t-SO7進入到E. coli χ13體內thyA突變位置處；

4. 用LB培養基培養E. coli χ13，篩選陽性的E. coli χ13，即：E. coli χ2；

5. SO7 蛋白在E.coli χ2里表達的鑒定：用SDS-PAGE和蛋白質印跡法來進行；
6. 用艾美爾球蟲卵囊對雞進行免疫和攻毒。免疫和感染程序見下圖：

                     

7. 用E.coli χ2介導的免疫反應；

8. E.coli χ2對同源感染的免疫效果的評估；
9. 數據分析。
 

注意事項

近年來活的弱毒苗已經開始使用了。然而，在使用這種疫苗時安全問題不容忽視，另外，大規模生產活的弱毒苗價格很昂貴，新一代的疫苗，像使用基因重組技術來表達寄生蟲抗原，將會產生更好的預防效果。

對于一個成功的重組疫苗來說，一種有效的抗原呈遞系統是至關重要的，抗原的入侵途徑和抗原的選擇也是影響成功的決定性因素。

在感染過程中，針對球蟲會產生特異性的抗體，而且這些抗體對處在細胞外階段的球蟲也能發生中和反應。