質譜分析法在微生物臨床鑒定中的應用

　　 19世紀末“正電荷粒子束在磁場中發生偏轉”被發現后，1912年世界上第一臺質譜儀在英國面世，從此一種通過測量離子電荷質量比，而進行樣品成分和結構分析的方法在生物學及醫學上大放異彩。質譜以其靈敏度高、特異性強、分析速度快、多指標同時檢測等特點躋身高端定量檢測分析儀器行列。

　　分辨率、靈敏度、質量范圍、質量測定準確性是衡量質譜的主要技術指標。分辨率R是指相鄰兩個峰被分離的程度，是質譜儀區別兩個峰的能力指標。靈敏度的指標實際上是儀器綜合性能的反映，因為它與樣品、分辨率、掃描速度、進樣方式以及電離方式密切相關。磁質譜儀器的質量范圍與加速電壓有關，在儀器最高加速電壓下可測的最高值為范圍指標，加速電壓降低，范圍加大，但靈敏度下降。

　　質譜工作原理，是將樣品分子經過離子化后，利用其不同質荷比（m/z）的離子在靜電場或磁場中受到的作用力不同而改變運動方向，使其在空間上分離，最后通過收集和檢測這些離子得到質譜圖譜，實現成分和結構分析。

　　質譜儀雖種類繁多，

　　但每種儀器結構可概括為以下6部分：

　　1.進樣口：直接進樣或接其他儀器，用于樣品的引入。

　　2.真空系統：用于維持質量分析器至檢測器部分的高真空狀態，使離子能夠在電磁場作用下自由飛翔，避免離子在運動途中發生碰撞，導致信號丟失或產生虛假信號。

　　3.離子源：用于將樣品離子化。

　　4.質量分析器：用于將不同質荷比的離子分離開，讓他們逐個進入檢測器，或只篩選特定質荷比的離子進入檢測器。

　　5.檢測器：通常是電子倍增管或其他，將離子的數量轉化為電信號的大小。

　　6.數據處理系統：處理檢測器捕獲到的電信號，獲得質譜圖，并進一步處理得到所需信息。

　　質譜種類多，應用廣。從用途（分析對象）可分為：無機質譜、有機質譜、同位素質譜及氣體質譜等。從單機或組合可分為：單（一）質譜、串聯質譜，單一質譜兩個及以上的組合即為串聯質譜。廣泛應用于化合物結構的定性測定或混合物組成的定量測定。飛行時間質譜儀（MADLI-TOFMS）歸類于有機質譜，可應用于臨床微生物（包括細菌和真菌）的高通量快速鑒定、疾控中心的微生物傳染病原的鑒定與監測、海關進出口商品的檢驗檢疫、食品生產中的微生物檢測和工業、農業和環境中的細菌監測等領域。

　　目前，服務于臨床診療的質譜檢測項目已達400余項，主要涉及臨床化學、臨床免疫學以及臨床微生物鑒定等領域，也被用于建立臨床化學檢測項目的參考測量程序和研制參考物質。歐美發達國家從1961開始將質譜技術用于新生兒篩查，目前實現使用串聯質譜技術對多個代謝產物進行聯合檢測，可篩查新生兒遺傳代謝病等30種新生兒遺傳代謝疾病。國內質譜的臨床檢測主要用于新生兒遺傳篩查、維生素D檢測、微生物診斷、藥品檢測等檢測領域。

　　相比國外100多年的質譜發展歷史，受限于國際離子源與質量分析器的核心ZL知識產權保護，國產質譜設備發展備受制約，直到2000年后國內企業才逐步開始質譜技術的積累。從2006年第一臺國產商業化質譜——四級桿氣質聯用儀問世，到17年7月國家質量監督檢驗檢疫總局和中國國家標準化管理委員會發布，18年2月份開始實施的推薦性國標——質譜儀通用規范。短短十年時間，以安圖生物為代表的6家國產IVD生產企業陸續推出MALDI-TOF 質譜儀，逐步打破以進口品牌壟斷為主的中國質譜格局，努力彌補當前國產質譜儀占有率相對較低，2016年抽樣調查中LC-MS及GC-MS國產化率均不到2%的差距，全力推進MALDI-TOF MS質譜在臨床微生物檢測領域的發展。

　　眾所周知，微生物診斷指的是通過病原學和藥物敏感性分析為臨床傳染性疾病的預防、診斷、治療與療效觀察提供依據。傳統微生物快速診斷包括三種方法：

　　1.樣品的直接檢測，例如PCR檢測；

　　2.菌體富集后檢測；

　　3.分離培養后檢測。

　　傳統的生物化學、分子生物學和形態學等方法基于單菌落的生化特征需要菌種的篩選、培養、鑒定等過程，實驗時間需要數天不等，耗時耗力，且實驗操作較為繁瑣，并不能滿足臨床對檢測結果時效性的要求；分子生物學方法進行微生物鑒定大大地提高了靈敏度和時效性，但對工作人員技術要求高，檢測成本高，僅針對某些特定細茵，難以滿足臨床常規要求。因而，樣本流轉（TAT）時間長仍然是當前制約臨床微生物檢驗發展的主要因素之一。MALDI-TOF MS質譜儀可實現臨床對部分微生物傳統檢測方法的技術替代，通過對未知化合物（菌）所得譜圖的分析，進而解析出化合物結構。MALDI-TOF MS快速鑒定經固（液）體培養基短時培養的陽性血培養物中的病原菌，且一次實驗可同時多個樣本檢測，準確率與檢測通量均有大幅的提升，一定程度上節省了人力和財力，可適用于微生物室日常工作的血培養陽性標本快速鑒定的方法。從而助力臨床微生物檢驗在感染性疾病診斷、臨床用藥指導、抗菌藥物管理、院內感染控制等多方面均衡發展，將徹底改變微生物實驗室的面貌。

圖.全自動微生物質譜檢測系統

（Automated Mass Spectrometry Microbial Identification System）

　　飛行時間質譜儀的質量分析器是一個離子漂移管。由離子源產生的離子加速后進入無場漂移管，并以恒定速度飛向離子接收器。離子質量越大，到達接收器所用時間越長，離子質量越小，到達接收器所用時間越短，根據這一原理，可以把不同質量的離子按m/z值大小進行分離。質譜圖，橫軸表示單位電荷質量（m/z）；縱軸表示離子流強度，通常以相對強度（相對豐度）來表示。相對豐度以最強的離子流強度定義為100%，其他離子流以其百分比顯示。

　　進樣系統、基質輔助激光解吸電離離子源、飛行時間質量分析器、傳感器和電腦是臨床微生物鑒定的 MALDI—TOFMS主要組成部分。MALDI—TOFMS鑒定微生物的標志物主要是特異性保守核糖體蛋白。MALDI—TOFMS基于微生物蛋白指紋圖譜的特異性峰譜進行鑒定，只需將細菌涂布于靶板，加入基質溶液裂解，室溫干燥后即上機檢測，獲取的質量圖譜與數據庫中的標準圖譜進行自動對比分析，即可獲得鑒定結果。鑒定結果全程自動判讀、自動分析、自動報告、標本自動卸載，20分鐘內可完成96個菌株的鑒定，且檢測成本低，儀器使用耗材只需樣品板和質譜專用基質，無須其他任何附加試劑，對工作人員的技術要求不高。

　　有研究證實，在重癥監護室（ICU）臨床治療中，抗生素如果晚一小時準確治療，病人存活率下降8%。而運用質譜檢測技術則可縮短至少1.5天的鑒定時間，為臨床救治危急重癥患者贏得更多時間。除單一質譜外，串聯質譜在美國及歐盟國家商業化應用相對成熟的主要是藥物濃度監測、小分子標志物檢測、新生兒篩查和維生素檢測等。國內除目前已實現商業化的微生物鑒定、新生兒篩查、維生素等臨床檢測領域外，應拓展質譜在血藥濃度監測領域的絕對優勢；緊抓質譜在小分子生物標志物在心腦血管和代謝病方面的發展趨勢，質譜儀因能敏銳地分析其他設備儀器難以分析的腫瘤生長分泌的微量外泌體，在癌癥的液體活檢領域，質譜檢測也有望跟基因檢測分一杯羹。

　　質譜作為一個能同時檢測大量的化合物的分析器，有望開啟IVD檢測發展的新篇章。從1953年飛行時間質譜儀原型被設計出，到1955年世界上第一臺飛行時間質譜儀誕生，再到國產飛行時間質譜迅猛發展，隨著臨床對個體化和精準化醫療需求的增加，基于質譜技術的基因組學、蛋白組學、代謝組學等很多研究成果正不斷轉化至臨床實踐，值得我們翹首以盼。

　　中國質譜儀過去面臨著4大挑戰，技術發展水平的挑戰、進口產品替代的挑戰、知識產權保護的挑戰以及做強、做大與做大、做強之間的挑戰。未來希望國內的質譜儀企業抓住全球市場需求增長率超過10%，以及中國市場遠超10%的需求增長，結合市場需求和實際情況，通過自身的努力，將更多精良的產品投入到市場中，從而推動中國質譜行業的快速發展。

　　參考文獻：

　　[1]中國臨床微生物質譜共識專家組.中國臨床微生物質譜應用專家共識[J]. 中華醫院感染學雜志，2016，26（10）

　　[2]李永軍,Sihe Wang.液相色譜-質譜聯用技術臨床應用[M].上海科學技術出版社

　　[3]中國質量檢測設備摸底調研.分析測試百科網.中金公司研究部