質譜沙龍第十九期活動報道

　　2009年5月23日，質譜沙龍第十九期活動在清華大學生物醫學測試中心舉行。此次到會者除了來自二炮總醫院、西苑醫院、清華大學醫學院、發酵研究院、中科院微生物研究所、空軍總醫院、天津博納艾杰爾科技、AB公司等老朋友外，還有來自戴安公司、東西電子的新朋友。報告后的討論一直洋溢著熱烈的氣氛。

　　第十九期質譜沙龍活動現場

 

　　清華大學生物醫學測試中心概況及ETD離子源介紹

　　首先由來自清華大學生物醫學測試中心的李春波老師，為大家介紹了《生物醫學測試中心概況及ETD離子源介紹》。

　　清華大學生物醫學測試中心 李春波老師

　　清華大學生物醫學測試中心下設實驗動物平臺、細胞生物學平臺、蛋白質化學平臺和同位素實驗室四個部分，主要為校內生物、醫學及相關學科的科研和教學工作提供技術支撐與服務，同時面向社會開放。

　　實驗動物平臺總面積超過2000cm²，被改造成為SPF級動物房。實驗設備配有病理切片系統和顯微操作系統。

　　細胞生物學平臺具備先進的活細胞共聚焦顯微鏡系統、美國BD公司生產的FACSAria Ⅱ流式細胞分選儀、德國蔡司LSM710激光共聚焦顯微鏡系統、以及日本OLYMPUS公司的雙光子顯微鏡，對生物樣品深度成像可達400微米。

　　蛋白質化學平臺主要儀器設備包括美國ABI公司4800plus  TOF/TOF質譜儀，Agilent 6300液相色譜質譜聯用儀，前端配有二維液相色譜系統，包括一個nano泵和一個capillary泵，并配有AgilentZL技術的Chip源，把二維的分析柱和Nanospray噴針整合到了芯片上，在噴霧的重現性和靈敏度上都比常規的nanospray源有提高。質譜上配備了ESI和ETD源，李老師實驗室配備的是安捷倫第二代的ETD源，是國內的第一臺安捷倫配備ETD源的質譜。還配備了Agilent1200常規液相色譜系統，主要為生物醫學方面提供簡單的純度分析和濃縮制備。

　　同位素實驗室主要配有液體閃爍計數儀、伽馬射線計數儀。

　　接下來，李春波老師簡單地介紹了ETD離子源。ETD(Electron Transfer Dissociation)即為電子轉移解離裂解源。

　　ETD作為一種新型的肽段序列測定技術,與FT質譜中的電子捕獲解離技術(ECD)具有類似的裂解過程。生物中常見的多肽蛋白質帶有多價電荷，通過對其轉移一個低能熱電子形成帶基電荷的離子后，該片段十分不穩定、會發生斷裂。

　　ETD本質就是一個負化學源，過程中需要甲烷氣體，首先在70eV的能量下激發后，甲烷氣體被電離，產生兩個低能的熱電子，熱電子被該離子源捕獲以后，形成一種陰蒽離子，該離子與高價多肽離子進行反應，把電子轉移到多肽離子上，這時多肽離子就會帶有一個基電子，帶了基電子后的多肽離子十分不穩定隨即在離子阱里發生斷裂。

　　一般CID源多產生b、y離子，而ETD源多產生c、z離子，結合CID的碎片后，對蛋白質的多肽序列覆蓋率會更高，這樣對于蛋白質的鑒定更好。同時，ETD比CID源也相對更溫和，在蛋白質的修飾測定方面，對修飾的基團進行保護，修飾的骨架不斷裂，從而更有利于翻譯后修飾的測定。

　　Thermo和Agilent/Bruker的ETD源的差別是：前者在阱的后端，后者在阱的前端。

　　ETD離子源相對CID靈敏度要低5~10倍，對單價或二價的多肽蛋白質裂解不具有優勢，如果蛋白量不多的話，并沒有優勢。而對于多價(≥3價)的多肽離子有優勢。在一個樣品中，可以只做CID，也可以只做ETD，也可以切換做，但是切換時對樣品量的要求就更多。一般來說，ETD做的一般都要>15個氨基酸，低于15個氨基酸的一般不斷裂，即一般對大分子量的多肽斷裂。當然，隨之帶來的是，GluC酶會比胰蛋白酶好，因為切出的肽段大一些。李老師還介紹了近期調節ETD的一些經驗，比如，需要調節陰蒽離子(m/z 202)的信號強度至少達到10e6左右，而其同位素峰203不能太高，這樣才能獲得較好的ETD斷裂效果。

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　　報告下載：《清華大學生物醫學測試中心概況及ETD離子源介紹》

 

　　生物質譜在微生物研究中的應用

　　來自中科院微生物研究所羅元明老師跟大家一起探討了《生物質譜在微生物研究中的應用》的報告。

　　中科院微生物研究所 羅元明老師

　　羅老師首先簡單介紹了中科院微生物研究所質譜技術平臺，該平臺包括ProteomeX二維液相色譜離子阱質譜聯用儀、4700 MALDI-TOF-TOF、GC-MS同位素比質譜儀，以及多臺HPLC和離子色譜等;并將要在近兩年內引進Triple Q三重四極桿質譜儀、高分辨串聯液質聯用如Q-TOF(或LTQ-Qritrap)等質譜。

　　羅元明老師根據自己多年的工作經驗，向大家介紹了質譜技術在微生物領域的研究內容，內容豐富翔實。

　　1、環境、能源及醫藥微生物學領域特定小分子結構鑒定

　　應用離子阱質譜技術，主要用來進行定性分析，鑒定是否含有某種已知小分子;檢測反應體系中的底物、中間產物及終產物，鑒定其結構，并建立了部分結構數據庫。

 

　　2、寡核苷酸的鑒定及定量

　　在微生物領域里有一些菌產生的蛋白，由于催化作用可以合成或降解為寡核苷酸，所以需要進行對該物質的鑒定及定量。

　　由十個堿基以上組成的多個核苷酸，樣品前處理中脫鹽步驟比較容易，羅老師在這里提出一個難題就是對于一些單核苷酸、二核苷酸就比較困難，一般的C18柱無法吸附，導致無法進行脫鹽。在座的戴安公司工程師提供了一些可能的解決方案， 比如離子交換柱。體積為幾個微升，絕對量對大概納克級。

 

　　3、寡糖鑒定-LC-MS/MS鑒定

　　在微生物領域里，一些真菌常見的致病菌的細胞壁是糖蛋白，一般研究糖蛋白的方法就是把蛋白質鏈上的寡糖切下來利用質譜技術進行鑒定。

 

　　4、蛋白質鑒定

　　蛋白質鑒定相對來說比較容易，該技術來羅老師實驗室送樣的也較多，不再詳細說明。

 

　　5、表達蛋白質組學研究

　　在微生物領域里，有些物種是中國所特有的，還有些物種是在特殊條件下形成的，所以研究其表達蛋白質組學是非常有意義的。除了研究細菌或細胞全蛋白質組外，還對細胞壁蛋白質組、細胞膜蛋白質組以及各亞細胞結構蛋白質組，及它們的比較蛋白質組和定量蛋白質組等進行研究。

　　目前比較蛋白質組學共有3條研究路線分別是：

• 　　比較經典的二維電泳(2DE)方法
• 　　基于穩定同位素標記的蛋白質組學分析方法
• 　　多維液相色譜質譜聯用技術

　　但第3條蛋白質組不能太大，因為太大的重現性不好，但對于蛋白質少的體系如細胞器蛋白質組，是可以應用該方法的。其中穩定同位素標記的定量蛋白質組學研究有3種方法。一是代謝標記，在體內細胞或細菌中利用沒有毒性的穩定同位素(¹³C, ¹⁵N)進行標定；二是可用的商業化試劑，例如ICAT和iTRAQ試劑；三是酶促同位素標記，一般應用的是¹⁸O進行標記，在酶切的時候加入H₂¹⁸O。

　　亞細胞蛋白質組研究中主要對膜蛋白質組、細胞壁蛋白質組、纖維小體蛋白組以及翻譯后修飾蛋白組進行研究。其中，真菌中的纖維小體常具有降解纖維素的活性，在生物能源中用得很多，其蛋白質組不是非常復雜值得研究。另外在翻譯后修飾的研究中，羅博士舉例了其小組研究煙曲霉(一種真菌)細胞膜的蛋白質組，找到了其糖基化的一些途徑，經過細胞學驗證后非常有意義，并進一步做了糖基化位點和結構的鑒定。

 

　　6、功能蛋白質組學研究

　　功能蛋白質組學的主要研究方向是蛋白相互作用、亞細胞定位以及翻譯后修飾等。

　　首先介紹了蛋白相互作用復合物的研究，并對儀器的分子量和分辨率提出了新要求：比如分子量為幾十萬的蛋白復合物，其分子伴侶很小，如用MALDI-TOF測定，反射時分子量范圍不夠，用線性模式分辨率不夠無法觀察分子伴侶;所以必須要上高分辨率(如Q-TOF或Orbitrap)的液質聯用，才能看到分子伴侶。

　　在蛋白質翻譯后修飾研究中糖基化、磷酸化、泛素化研究相對來說是比較難的，其它的相對簡單，不需要特異的富集;接下來主要介紹了這幾種情況的分析方法。

　　蛋白質糖基化

　　在真核中總結的規律是：最常見的是在天冬酰氨的N-糖基化和發生在絲氨酸的O-糖基化。糖基化物質相對來說比較少，所以在質譜上顯示峰度很低，所以一般需要富集;或采用熒光染料或化學試劑進行染色處理。

　　羅老師在這里例舉了利用苯肼標記膜蛋白中的糖蛋白使其穩定，收集后會產生長短不同的寡糖多肽，選用最長的兩段(m/z 1021.30和1224.55)利用液質聯用技術進行糖蛋白中N-連接寡糖位點和結構的鑒定。

 

　　蛋白質磷酸化

　　蛋白磷酸化也是有規律的，位點一般發生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸這類氨基酸上。分析步驟一般首先鑒定蛋白質，鑒定后通過數據庫尋找到它的磷酸化一級碎片，通過優化能量，得到信息比較詳細的二級碎片，把帶有磷酸基團的碎片標記上，就說明鑒定是成功的。由于磷酸化信號很弱，一般利用磷酸化抗體進行富集處理;也可利用結合親和色譜螯合離子/金屬離子的方法(如Fe³⁺、Ga³⁺)。Millipore公司也提供Tip頭吸附來富集;也有人用熒光染色的方法來找到磷酸化的蛋白質。

 

　　蛋白質甲基化

　　蛋白質甲基化一般發生在賴氨酸上，產生單甲基化、雙甲基化和三甲基化，少數情況也發生在谷氨酸上。羅老師介紹了其發表在核酸研究(Nucl Acids Res)上的工作：研究了一種嗜熱菌，首先采用MALDI-TOF質譜技術，觀察到峰之間都相差14Da，推測可能是甲基化反應，然后酶切后作一級質譜找甲基化片段，在TOF/TOF二級質譜上找到賴氨酸標記的甲基化14的片段。羅老師也提到，甲基化/乙基化相對糖基化/磷酸化好做一些;另外該實驗測定的只有6000 Da的蛋白，MALDI-TOF尚可，以后做到更大的，只能用高分辨的液質聯用。

 

　　7、末端蛋白質組學

　　末端蛋白質組學是比較前沿的技術，羅老師在這里提出了以下幾個問題：

• 　　為什么同一蛋白在1DE和2DE中出現在不同的位置?有些可能是人為操作引起的，有些是不同功能的蛋白存在不同的修飾本身就會分開，如何鑒定?
• 　　如果物種的基因組未測序，怎樣才能知道蛋白序列?因為不可能把每一種物種的全基因組都測序，蛋白質又存在各種剪接、加工、修飾，并和功能相關。
• 　　怎樣判斷所表達的蛋白在不同位點終止以及不同修飾(C-末端鑒定)?
• 　　怎樣判斷N-末端的信號肽、是否是甲硫氨酸Met起始及其他修飾?
• 　　代謝組學領域活性多肽或修飾片段的鑒定。

　　所有以上問題是蛋白質功能研究所必須解決而不可避免的問題，也是目前功能基因組研究的熱點和難點，所有這些問題的解決都可能從末端測序找到答案，雖然大量文獻報道C末端或N末端標記，但目前沒有成熟穩定的技術。標記技術如穩定，從末端的測序和解譜是相對容易和可能的，另外，標記后要能夠純化出來。

　　在談完對末端標記/測序技術的暢想外，羅老師還提出了兩個難點，希望大家多探討：

　　(1) 在定量蛋白質組學里，尋找微量物質和準確定量的問題，目前多用標記，但標記重復性和標記效率都有待提高。

　　(2) 對一些分子量比較大的蛋白復合物的研究，除了對儀器性能要求較高以外還存在一些比較復雜的難點。

　　本網收錄前沿Lab：中科院微生物資源前期開發國家重點實驗室蛋白質組學研究平臺

　　報告下載：《生物質譜在微生物研究中的應用》

 

　　中藥人參皂苷類成分質譜測定的方法研究

　　最后由來自西苑醫院的林力老師為大家帶來了《中藥人參皂苷類成分質譜測定的方法研究》報告。

　　西苑醫院 林力老師

　　人參主要包括皂苷類、多糖類和氨基酸類這三種成分。林力老師主要研究的是利用質譜技術測定人參皂苷類的成分。

　　初期實驗方法的問題

　　在初期建立分析方法中，經過檢測后存在以下幾個問題：

　　1、不多

　　只選擇了Rg₁、Re、Rb₁、Rd這4個成分進行檢測，而皂苷類物質成分很多;

　　2、不快

　　在質譜分析中的保留時間為15min，應優化保留時間;

　　3、不好

　　檢測靈敏度不高，在高劑量給藥時Rg₁、Re能檢測到，而在中劑量和低劑量給藥時，Rg₁、Re檢測點就十分少，所以需要優化色譜和質譜條件，來提高檢測靈敏度。

　　4、不省

　　溶劑流速0.5ml/min，相對消耗較多。

 

　　實驗方法的改善

　　根據以上問題，林老師接下來從以下幾個方面進行了分析方法的優化和解決。

　　入血成分解析

　　人參皂苷類成分在體外能檢測到幾十種，而在體內由于生物屏障的影響入血成分很少。首先采用AB公司的4000 Qtrap進行定性分析，對大鼠給藥后的入血成分進行結構解析。采用在前期預實驗中比較好的吸收點，對該點進行富集之后采用Q3 MS-IDA-EPI-EPI(即二級全掃描)的方法進行檢測。

　　在血液中可以檢測到的化學成分包括原人參二醇型的Rb₁、Rd、Rc、Rb_2/3;原人參三醇型的Rg₁、Re、Rf、Rg₂和齊墩果酸型中的Ro。其中Rg₂、Ro檢測點很少，所以主要檢測其它幾種化學成分。

　　仔細分析這些成分的化學結構可以得到更多的信息。Rd和Re的分子式和分子量是完全一樣的，唯一的區別就是分別為二醇型和三醇型。從質譜圖上可以很容易地區分這兩個成分。

　　而屬二醇型的Rc、Rb₂和Rb₃分子式和分子量完全一致，屬于同分異構體。在質譜圖中可以發現Rb₂和Rb₃由于分析結構式十分接近所以很難分離，而Rc與Rb₂和Rb₃之間也比較接近，所以需要優化其色譜參數，經過反復的分離之后才能達到理想的效果。

 

　　調整固定相

　　由原先采用的SB-C18(150×4.6 mm ，5mm)柱子，改為Symmetry C18(150×2.1 mm ，5mm)柱子。這里面還有一個插曲，原來用2.1mm色譜柱不理想，因為液相系統死體積過大，后來用4.6mm，在溶劑耗費、靈敏度、穩定性等方面還是不理想，改回2.1 mm前，把液相的管路全換成了低死體積的，才最終解決了該問題。

 

　　調整流動相

　　經過大量實驗得出，乙酸銨系統靈敏度高，但是受血漿干擾大穩定性不佳，甲酸系統靈敏度低但是抗干擾能力強。甲酸的濃度、起始水相的比例以及梯度對檢測靈敏度都有一定的影響。最后選用的是甲酸體系。

 

　　四元泵問題

　　林老師在這里提到一個問題就是確定檢測方法之后，在隔天進行檢測時發現保留時間有所變化。經過反復實驗得出原因應該是由于流速偏低，使得泵的精度有些差異，解決方案是對單個泵先采用高流速沖洗之后，選擇初始有機相比例再用高流速進行沖洗，再去平衡色譜柱，之后保留時間就會恢復到原先的檢測結果。因此林老師強調指出不要忽視液相系統在質譜定量中的作用。

 

　　達到預期目標

　　最終采用水相：0.01%甲酸水，有機相：甲醇/乙腈混合液(含0.01%甲酸);230uL的流速，柱溫25℃的檢測條件，基本解決了初期檢測中的問題。

　　1、多

　　檢測成分由開始的4個增加到7個(Rb₁、Rd、Rc、Rb_2/3、Rg₁、Re、Rf)。

　　2、不快

　　保留時間為15min優化到14.5min，對于該液相系統基本上已經達到最佳優化時間。

　　3、好

　　檢測靈敏度由1 ng/mL提高到0.06ng/mL。

　　4、省

　　溶劑流速由0.5ml/min降低到0.23ml/min。

　　最后林老師根據自己在實驗中的心得體會，在多成分定量分析研究中總結了幾點應當注意的環節。

　　一是內標的選擇，在多組分定量中選擇一個恰當合適的內標是十分困難的，最后這個實驗還是用的外標法，因為內標很難保證所有組分都滿足藥動要求;二是樣品前處理中選擇前處理方法要同時兼顧到多成分的化學性質，該實驗最終選用的是液液萃取，因為固相萃取對某些組分存在嚴重吸附洗脫不下來;最后一點就是在進行多成分同時檢測時不要單單按照正離子或負離子進行分類，還要考慮到按化學性質進行分類。

　　獲得這些結果，林老師花費了一個月的時間主要來優化色譜條件，他最后的總結對每個液質聯用工作者都很有借鑒意義：完成一個實驗，質譜上花的精力大概是10%，而色譜上要花費90%的精力。

　　本網收錄前沿Lab： 中國中醫科學院西苑醫院 藥代動力學實驗室

　　報告下載：《中藥人參皂苷類成分質譜測定的方法研究》