輔料的液相檢測

　　前言

　　隨著固體制劑的一致性評價的推進，以及注射劑安全性評價即將來臨，藥用輔料的質量研究越來越受到重視。HPLC技術作為現代藥品檢驗重要的檢測手段在藥用輔料檢驗中也發揮著重大作用。本文簡介HPLC在藥用輔料檢測中應用。

　　1、概述

　　藥用輔料是指藥物制劑中除主藥以外的一切成分的統稱，包括藥品的賦形劑和其他附加劑，為了改善藥品的安全性、有效性、穩定性、依從性等而加入的物質。在藥物制劑反向工程，以及藥用輔料安全評估研究中，藥用輔料檢測方法尤為重要。由于大多數藥用輔料沒有紫外吸收，用HPLC檢測，除了使用常用的UV檢測器外，還需聯用ELSD、CAD、MS等通用型檢測器。

　　中國藥典收錄的藥用輔料，例如阿司帕坦、聚甲丙烯酸銨酯Ⅰ、聚甲丙烯酸銨酯Ⅱ、DL -蘋果酸、富馬酸、明膠空心膠囊、大豆磷脂、蛋黃卵磷脂等均應用HPLC 法檢查有關物質；β -環糊精、膽固醇、麥芽糖等均應用HPLC法測定含量。隨著我國藥用輔料品種迅速增加及藥用輔料的檢測標準逐漸完善，結果精準、操作簡便的HPLC 法得到廣泛應用和發展。

　　2、HPLC-UV法

　　紫外檢測器用于檢測具有特定吸收波長，并在該波長下響應值（A）與濃度（C）成正比的物質。許多藥用輔料如醇類、酮類、酯類、酚類等都具有紫外吸收性質，因此針對這類輔料HPLC-UV是首選方法。

　　苯甲醇是注射劑中常用的抑菌劑，但過量苯甲醇可對人體產生毒副作用，如靜脈注射刺激性、鞘內注射神經毒性、過敏反應等不良反應。通常藥典收錄苯甲醇的檢測方法是GC方法，文獻[1]建立HPLC-UV法測定鹽酸林可霉素注射液中苯甲醇的含量。采用DiamonsilC18 色譜柱，以0.05mol/L 硼砂溶液-甲醇-乙腈（67:33:2）為流動相，檢測波長為214nm。結果在0.01903～0.32572mg/mL與峰面積線性關系良好（r＝0.9999），平均加樣回收率為100.6%.

　　檸檬黃、莧菜紅等是常用的人工合成色素，主要用作膠囊殼和糖衣的著色劑。收載于中國醫藥行業標準中。原標準采用三氯化鈦滴定法測定含量，操作繁瑣費時，測定結果誤差較大。采用AgilentZorbax SB-C18 色譜柱，文獻[2]以甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（20:80）為流動相，檢測波長為226nm，檸檬黃線性范圍為0.050～1.000μg/ml（r＝0.9999），平均回收率為99.9%。

　　3、HPLC-RID

　　示差折光檢測器（RID）是一種最早應用于HPLC 的通用型檢測器。其在聚合物、糖類、有機酸、甘油三酯、高分子化合物、脂肪烷烴等物質測定方面具有獨特的優勢。輔料中糖類、酯類物質種類多，用途廣泛，因此HPLC-RID法在藥用輔料檢測中也發揮著重大作用。

　　麥芽糖在藥物制劑中可作為等滲調節劑、黏合劑、賦形劑等。日本藥局方ⅩⅣ版、USP30版均已收載，并采用強酸性陽離子交換柱測定。但這種填料的色譜柱價格昂貴、保存難度較大、柱效易降低，檢測器溫度過高，研究成本較高。針對糖類，安捷倫Zorbax碳水化合物柱可將8種糖完全分離，且檢測限為10ng。如圖1所示。

圖1 核糖、鼠李糖、木糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖依次在捷倫Zorbax碳水化合物柱分離色譜圖

　　單硬脂酸甘油酯在藥物制劑中常作為固體酯質納米粒的骨架材料或非離子型乳化劑，是制備膠囊的材料之一，也常被用作穩定劑、潤滑劑和增塑劑。雖然是一種常用的藥用輔料，2015版中國藥典卻未收載。GB15612-1995 標準中的單硬脂酸甘油酯的含量測定方法是化學滴定法，此方法步驟繁瑣費時，影響因素多，測定結果的不夠準確。

　　文獻[3]建立了HPLC-RID法測定單硬脂酸甘油酯的含量。采用Waters Sunfire C18色譜柱，以四氫呋喃為流動相，因其在紫外檢測器中沒有吸收，故采用RID。所建方法靈敏度高，簡便快捷，適用于單硬脂酸甘油酯的含量測定和質量控制。

　　RID是通過比較折光率的變化來檢測流動相中的樣品峰。對于無紫外吸收或只有紫外末端吸收的物質，用HPLC-UV檢測時靈敏度相對較低，同時易發生基線噪音大，而用HPLC-RID法可取得較為理想的結果。

　　但是RID 對多數檢測物質（除糖類檢測限可達1×10-8g/mL）檢測靈敏度較低（約1×10-5g/mL），對環境溫度、流動相組成的微小變化非常敏感，必須控溫，且不適于梯度洗脫，這些固有的缺陷在某種程度上限制了其應用。

　　4、HPLC-ELSD法

　　目前蒸發光散射檢測器（ELSD）越來越多的作為通用型檢測器用于HPLC。其最大的優越性在于能檢測不含發色團的化合物，如：碳水化合物、脂類、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性劑，并能在沒有標準品和化合物結構參數未知的情況下檢測未知化合物。這些優勢為其在藥用輔料檢測應用奠定了良好的基礎。

　　聚山梨酯-80是一種非離子型表面活性劑，廣泛用作藥用輔料中的乳化劑和增溶劑。目前國內外均有臨床安全性問題報道。中國藥典收錄了比色法測定聚山梨酯-80含量的方法。雖然該方法對于設備要求較低，但其耗時較長，準確性及重復性較差。

　　文獻[4]建立了HPLC-ELSD法測定莪術油注射液中聚山梨酯-80 的含量。采用TSK-GELG2000 SWXL 色譜柱，20mmol/L乙酸銨 -乙腈（90∶10）為流動相。該測定方法線性范圍較寬，線性關系良好（r＝0.9978），加樣回收率為102.5%（RSD ＝0.60%）。本方法快速、準確、穩定，可用于莪術油注射液中聚山梨酯-80的質量控制。

　　卵磷脂是一種天然的兩性表面活性劑，化學名稱為磷脂酰膽堿。在藥物制劑中常用作乳化劑、增溶劑。中國藥典有收錄蛋黃卵磷脂中磷脂酰膽堿和磷脂酰乙醇胺的檢測方法。用硅膠柱為填充劑，以甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（85:15:0.45:0.05）為流動相A，以正己烷-異丙醇-流動相A（20:48:32）為流動相B，梯度洗脫，檢測器為蒸發光散射檢測器。

　　目前也有用C18/C8/C4為固定相，以甲醇-水-三氟乙酸為流動相的反相色譜體系，蒸發光散射檢測器檢測。

　　ELSD 對所有不揮發溶質都有響應，是一種較理想的通用檢測器。相比于同為通用型檢測器的RID，其靈敏度高，檢出限約為10 ng，不受溶劑成分及溫度波動的影響，亦可用于梯度洗脫。其最大的缺陷在于其流動相需采用揮發性的鹽（如醋酸鹽、甲酸鹽），對于一些揮發性比較強的成分，可能在較高的溫度下會隨著流動相揮發成氣體狀態，不適于用HPLC-ELSD檢測。

　　5、HPLC-MS法

　　MS是強有力的結構解析工具，能為結構定性提供較多的信息，作為理想的色譜檢測器，不僅特異性強，而且具有極高的檢測靈敏度。LC-MS聯用技術突破了過去對含量低、不易分離或缺乏紫外吸收的物質難于檢測的瓶頸，成為藥物鑒定分析的重要研究手段。不需衍生化步驟，可以直接分析不揮發性化合物、極性化合物、熱不穩定化合物和大分子化合物。以上MS的優勢也成為了其在藥用輔料檢測中得到迅速推廣。

　　鄰苯二甲酸二辛酯（DOP）為一種藥用輔料塑化劑。在腸包衣的片劑類、乳劑類和緩釋類藥品中使用。若長期服用可能引起生殖系統異常、甚至造成畸胎、癌癥的危險。

　　文獻[5]建立了LC-MS檢測硫酸亞鐵緩釋片中鄰苯二甲酸二辛酯含量。采用Waters BEH C18 色譜柱，流動相為95% 甲醇-5% 乙酸銨溶液梯度洗脫，質譜采用電噴霧離子源，多反應監測模式（正離子）。所測結果DOP 在0.0913～ 0.9130ng 內與峰面積線性關系良好（r＝0.9973）；以加標樣品計算，在低、中、高3 個濃度水平下，DOP 平均回收率為98.5%，定量限為0.05ng，檢測限為0.01ng。

　　本方法采用多反應監測模式，顯著提高了檢測的靈敏度和專屬性，且樣品處理操作簡便、快速，適用于硫酸亞鐵緩釋片中DOP的含量檢測。

　　糖醇也稱為多元醇，這類物質是糖的還原產物，糖醇在藥物制劑中常用做輔料，充當矯味劑和填充劑等。糖醇本身在紫外區域或可見光范圍沒有吸收，也無熒光，采用HPLC-RID 測定糖醇時，定量水平僅為0.1g/L數量級。

　　若通過衍生化的方法將樣品組分制備成具有紫外吸收或能發出熒光的物質，用紫外、二極管陣列或熒光檢測器，分析靈敏度可大大提高，定量水平達到0.01g/L數量級，但樣品制備操作繁雜。

　　LC-MS法對進口碳酸鈣咀嚼片中的輔料單糖醇進行分析鑒定，色譜柱為Hypersil NH2 柱，流動相為乙腈 -水（80 ：20），定量水平可達到0.1mg/L數量級。

　　隨著MS 技術的成熟與開發，復雜基質中樣品的原位與直接分析，多樣品的結構解析，有關物質的分析等都是MS 的主要應用方向。這些應用方向均與提高藥用輔料質量標準的要求相契合。

　　6、其他HPLC檢測方法

　　高效液相色譜 -電感耦合等離子體質譜聯用技術（HPLC/ICP-MS）作為微量元素的測定最有效的途徑之一，HPLC 高分離度與ICP-MS低檢測性、寬動態線性范圍及能同時測定多種元素、跟蹤元素的變化等特點融合，目前已廣泛的用于食品、環境、體內外藥物分析中微元素的測定。

　　該方法應用于藥用輔料中微量元素砷、汞、鉻等檢測的探索性研究項目已在試驗室開展，隨著技術的成熟與儀器的發展，其在藥用輔料檢測中有著廣泛的應用前景。

　　高效液相色譜-核磁共振聯用技術（HPLC-NMR）因儀器昂貴，NMR 靈敏度相對較低，液相色譜需使用氘代溶劑，溶劑信號易對樣品產生干擾等，使其在藥物分析中廣泛應用存在一定障礙，但NMR 在結構分析方面有獨特的優勢，能夠提供最豐富的結構信息，彌補HPLC通用檢測器只能得到非常有限的結構信息的不足，在實際藥用輔料雜質分析中已進入使用階段。

　　7、小結

　　綜上，HPLC與不同檢測器的聯用，可以應用于不同種類的藥用輔料分析，并且各具優勢。HPLC法在藥用輔料分析中正逐步取代某些原有的繁瑣的化學反應測定、不精確的比色測定等，在藥用輔料分析中發揮重大的作用。隨著輔料質量標準的提高與檢測制度的完善，新型色譜、光譜、質譜、核磁共振的方法以及各種聯用技術的開發與應用是未來的必然趨勢。

　　本文是筆者查閱一些文獻以及日常工作的小結，如有錯誤，敬請指出。感謝雷諾島對本文的編輯。