酶標法測定碳水化合物含量

實驗概要

在真核和原核生物中，糖不僅是重要的能源和結構成分，而且是控制生理、代謝、細胞周期、發育和基因表達的中心調節分子。在高等植物中，糖影響生長和發育的整個生命過程，從種子萌發到開花直至最后衰老。越來越多的證據表明糖作為生理信號，調節著植物基本生理過程的許多基因的表達，包括光合作用、乙醛酸代謝、呼吸作用、淀粉和蔗糖的合成及降解、氮的固定作用、儲藏蛋白的合成、病原防御、損傷反應、細胞周期的調節、色素的合成以及衰老反應。本實驗用酶標法測定了擬南芥碳水化合物含量。

實驗原理

1 mol的己糖經過酶反應，最終轉化稱6-Phosphogluconat均伴隨著1 mo1NADPH的產生，通過測定NADPH在340nm的光吸收，即可測定樣品中的己糖含量。

主要試劑

1. 溶液的配制

1mM glucose

1mM fructose

1mM sucrose

500mM TRA buffer pH 7.4   TRA=triethanol amino

2M MgSO₄

200 mM ATP

200mM NADP

以上的溶液均需于-20^oC保存

Acetate buffer 0.1 M，pH 4.6

10ml 1N acetic acid(醋酸) 5m1 1N NaOH，加dd H₂0至90m1，調pH至4.6，定容至100mI。

2. 反應混合液(testmix)的配制((1 ml可點96孔，可根據需要配制一定體積，盡量少，因為酶價格較貴)

5ml TRA 500mM，pH 7.4(鹽酸二乙醇胺溶于水，1 N NaOH調pH 7.4)

15ul MgS0₄(2M)

100ul ATP(200mM)

100ul NADP (200mM)

10ul Glucose-6-phosphat Dehydrogenase(G6P-DH，Grad II，140U/ mg)

3. 各種酶的配制

Hexokinase：用水1: 200稀釋母液(母液濃度15000U/ml)

Phosphogluco-isomerase：用水1: 200稀釋母液(母液配制:350U/mg10mg/ml)

Invertase：0.3mg干粉溶于1 ml醋酸緩沖液(pH4. 6，0.1 M)

Amyloglucosidase：6.09mg/ml (21.3U/mg)

實驗步驟

1. 樣品制備

    1) 用液氮收集植物材料，將材料用冷凍真空干燥儀充分干燥，將干燥后的材料1密封保存在-20^oC。

    2) 稱取2-4mg干燥的材料與l0mg PVPP，lmg活性炭充分混勻，沸水浴20分鐘，置于冰上冷卻。

    3) 加入200ul重蒸水，充分研磨，室溫放置25分鐘。

    4) 10000rpm離心10分鐘。吸取100u1上清液，進行可溶性糖的測定。

    5) 剩余部分加入100ul醋酸緩沖液(pH4.6 )，混勻后沸水浴15分鐘，冷卻至室溫，加10ul amyloglucosidase充分混合，37^oC水浴保溫過夜。

    6) 離心10min，取出100ul上清液，用作淀粉測定之用(可于-20 ^oC或-80 ^oC下保存備用)。

2. 酶標法測定

    1) 葡萄糖、果糖、蔗糖的測定

        a. 樣品配制

按下表將各種成分混合

HG示空白對照，St為標準樣品，sample為待測樣品

        b. 點樣

將樣品按下表順序點入96孔比色板

每個樣品測3個重復。

        c. 測量

將比色板放入酶標儀讀取數據，待讀數穩定后記錄。

取出比色板，將每個孔中加入稀釋好的Hexokinase  10ul，放入酶標儀反應30分鐘，其間每5分鐘測量一次數據，將穩定后的數據記錄。取出比色板，將每個孔中加入10ul稀釋好的Phosphogluco-isomerase，放入酶標儀反應30分鐘，其間每5分鐘測量一次數據，將穩定后的數據記錄。取出比色板，將每個孔中加入50ul稀釋好的Invertase，放入酶標儀反應45分鐘，將最后穩定的數據記錄。

        d. 計算

記錄的每組數據及相關的實驗參數輸入計算軟件，即可得到各樣品中3種糖的含量。

2) 淀粉的測定

        a. 樣品配制

將經過Amyloglucosidase消化的樣品按下表混合

根據樣品淀粉含量的多少，水與樣品的比例可適當調整在最后輸入軟件計算時，實驗參數都應相應修改。

        b. 點樣

方法同上

        c. 測量

將比色板放入酶標儀讀取數據，待讀數穩定后記錄。取出比色板，將每個孔中加入稀釋好的Hexokinase 10ul，放入酶標儀反應30分鐘，其間每5分鐘測量一次數據，將穩定后的數據記錄。

        d. 計算

將記錄的每組數據及相關的實驗參數輸入計算軟件，即可得到各樣品中淀粉的含量。