非洲爪蟾卵母細胞體外翻譯系統

成年雌性非洲爪蟾 抑肽酶 tRNA 蛋白酶 K

離心機 冷室

一、材料與設備

(一) 非洲爪蟾卵母細胞提取物的制備

1) 成年雌性非洲爪蟾：數只。

2) 高鹽的 ModifiededBarth、X(MBS): 每升溶液中補加 1.28 gNaCl, 以使其終濃度達到 llOmmol/L。

3) 血漿促性腺激素和絨毛膜促性腺激素。

4) 溶液 A;2% 半胱氨酸的鹽酸溶液，用 NaOH 調節 PH 至 7.7。

5) 溶液 B(抽提緩沖液）：100mol/LKCl,0.1 mmol/LCaCl2,1 mmol/LMgCl2,50 mmol/L 蔗糖和 10 mmol/LHEPES-KOH(pH7.7)

6)VersilubeVF50: 密度介于蛙卵和溶液 B 之間

7) 細胞松弛素 B: 在 4℃, 以儲存于 DMSO 中

8) 抑肽酶: 在—20℃, 以 10 mg/ml 儲存于水中

9)RNaseA：以 1 mg/ml 溶于水中；分裝后存于一 20℃

10）核糖核酸酶抑制劑。

11)DTT:lmol/L，分裝存于-20℃。在加入抽提物之前應現稀釋成 lOOmmol/L使用。

12)tRNA: 以 5 mg/ml 溶于水中，分裝后存于一 20℃

13) 離心機。

14) 冷室。

(二）非洲爪蟾卵母細胞提取物的翻譯

1) 磷酸肌氨酸：350 mmol/LL，儲存于-20℃

2)[32S]-甲硫氨酸：100uCi/管分裝, 儲于一 70°C

3) 亞精胺：120 mmol/L，儲存于一 20℃

4) 兔網織紅細胞裂解液/S-100 提取物：如要去除反應中外源的核糖體，那么就必須制備 S-100 片段. 假如對外源性的核糖休并無特殊要求，那么可用經核酸酶處理過的網織紅細胞裂解液代替 S-100 片段。制備 S-lOO 的方法.. 將 100ul 網織紅細胞裂解液以 100000 g 離心 2 h，可得到約 80ul 的上清液。將上清以 10ul 的休積分裝后，立即置入液氮中快速冷卻，然后儲于一 70℃ 備用。注意：在移出上清時不要吸入核糖體

5) 離心機

6) 冷室

(二）翻譯產物的分析

1)10%TritonX-100: 在開封后，未用的溶液應于 4℃ 避光保存

2)PMSF

3)TritonX-100,1 mmol/LPMSF: 新鮮配制

4)2XT 緩沖液：100 mmol/LKCl,10 mmol/L 乙酸鎂，200 mmol/LNaCl 和40 mmol/LTris-HCl(PH7.5)D 超濾火菌后存于一 20℃。產物可與 40% 的蔗糖儲液混合，分別稀釋成 1XT+10% 和 1XT+20% 蔗糖溶液，未使用的 lXT-f10% 和 1XT+20% 蓆糖溶液可存于一 20℃

5) 蛋白酶 K:25 mg/ml 儲于 50% 甘油屮

6)Na2CO3: 對于每一個堿性蔗糖密度梯度分離實驗，應新鮮配制 1mol/L 儲液，其 100 mmol/h 溶液 PH 應為 11, 儲液用水以 1:5 的比例稀釋成 200 mmol/L 的使用液. 用以處理膜片段。另外，儲液還可以與 40% 的蔗糖溶液混合（1 體積的 1moL/L4 體積的水和 5 體積的 40% 的蔗糖溶液）以制成 20% 的蔗糖密度梯度。

7)1mol/LHCL

8) 絲氨酰醅氨酰天冬酰胺（ThrTyr-Asn): 由于其在水中的溶解件不好，因此儲液一般用 DMSOS 成 lOOmmol/L 使用時，吋用儲液做相應稀釋。

9) 離心機。

10) 冷室.

二、操作方法

(一）非洲爪蟾卵母細胞提取物的制備

1. 基本提取物的制備

整個操作過程進行得越快. 所得的最終提取物的翻澤效果就越好，因此，在開始制備提取物之前，應務必確定是否所有的緩沖液、試管和離心機轉子都預冷到 4°C，以及確定所有必需的材料都備齊。另外，除非溫度被特別指出，否則在上述的笫 2) 步之后的所有步驟都應在 4°C 冷室中置于冰浴上迸行

1) 挑選較大的成年雌性非洲爪蟾數只，于第 1 天給每只注射 50?1O0U 的血漿促性腺激素，3?5 天之后，即在制備提取物的前一天晚上再向每只非洲爪蟾注射 500?750U, 絨毛膜促性腺激素，以誘 K 排卵。之后，非洲爪蟾被放置過夜，并使之將卵排到商鹽的 MBS 中，以保持卵的生物學活性

2) 將約 30 ml 的松散結合的卵轉移到一個 250 ml 的廣口玻璃杯中，用高鹽的 MBS 反復沖洗幾次后，用塑料移液管吸去細胞碎片以及已死亡的卵細胞。盡可能多的去除上清緩沖液加人 100 ml 溶液 A, 重復以上操作 2?3 次。^不時渦旋振動懸浮的卵，并持續 5?lOmin 當蚌卵所占的體積顯著性的減少時，說明卵外層的膠狀衣鞘已逐漸溶解。此時，聞用溶液 A 沖洗蛙卵，然后棄去溶液，重復兒次后將蛙卵轉人冰預冷的溶液 B 中，

3) 用廣口移液管耗輕將蛙卵吸到 4 個 2 ml 的離心管巾，在此過程中應盡可能少的吸入浴液 B 上，蛙卵靜置約 1 min 后仔細地吸去上清，然后在液面上梗蓋一層 VersihjbeVF50, 并于 4℃ 以 500 g 離心 1 min。離心后，蛙卵應緊靠在一起，但不應破裂。離心結束時. 溶液 B 應位于最上層，Vei^lubeVF50 層位于中間，而蛙卵則位于最下層。

4) 用 200ul 移液器小心地移去上層緩沖液及油層，然后將離心管置于離心機中，于 4℃ 以 20000 g 離心 15 min, 以裂解蛙卵。預期的離心產物山多層細胞裂解產物所組成，而其中黏稠的琥珀色的屮間層大約占 40% 的體積，這就是目的產物，即細胞質。用塑料移液管穿過脂質的薄層插入到中間層中. 使細胞質轉移出來。

5) 從所有的離心管中將產物一移出，估汁體積后按 5ul/ml 的量加入 10 mg/ml 的細胞松弛素\輕輊吹打混勻后，將混合物轉入新的 1.5 ml 離心管中，于 4℃ 以 20000 g 離心 15 min，離心后, 細胞質應占絕大多數的休積，在將其移出時，應十分小心以避免吸出底部的沉淀。

6) 按 1ul/ml 的量加入 10 mg/ml 抑肽酶，輕較充分混勻。

提取物可以用于翻譯反應、凍存，也可按如下步驟對其中的內源性 mRNA 進行去除。

2. 內源性 mRNA 的去除

像制備基本提取物時一樣. 內源性 mRNA 的去除也最好在冷室中進行。

1) 稀釋 RNaseA 儲液的濃度到 100X 的使用液。

2) 按 lul/管的量向具有螺旋蓋的 1.5 ml 的離心管屮加入稀釋好的 RNawA, 然后向每管中加入 100ul 提取物，上下吹打混勻。置 10℃ 孵育 I5 min

3) 將離心管背于冰上，按 1ul/管的量加入 100 mmol/LDTT，接著按 50U/管的量加入 RNa 此抑制劑。充分混勻，置 10℃ 孵育 15 min,, 按 2ul/管的最加入 5 mg/mltRNA.去除了內源性 mRNA 的提取物可以立接用于翻譯反成，或盡快凍如液氮中備用

(二）外源 mRNA 在非洲爪蟾卵母細胞提取物中的翻譯

1) 室溫融化凍存的提取物，然后即置于冰上。

2) 同時，應將用于翻譯的 mRNA 分裝于 0.5 ml 或 1.5 ml 離心管中，置于冰上

3) 每 100ul 提取物應分別加入以下各成分：10ul 網織紅細胞裂解液 S-100,1ul120 mmol/L 精胺，2.5ul350mol/L 磷酸肌氨酸和 lO0ulCi[35S]-甲硫氨酸。按 10?50ul/管的量向盛有 mRNA 的離心管屮加入此種混合物，混合均勻后，置 21℃ 孵育 lh

4) 如果具有高放射件活性的體外合成 mRNA 被用于翻譯，則在反應結朿時應加入lOug/mlRNaseA 并置于 21°C 孵育 15 min，以除去由放射性 mRNA 帶來的將會妨礙進一步分析的放射性背景。

5) 如需儲存，反應可在此步通過冷凍加以終止

6）如用凝膠電泳分析或 TCA 沉淀反成，在加入等體積的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳加樣緩沖液或篩選過濾前, 應向反應產物加入 1%X-100 和 lmmol/LPMSF

(三）翻譯產物的分析

對翻澤產物逬行普通的凝膠電泳常常可揭不其分泌表型：假如位爭肽序列被切割，則
分子質覽通常町減少 2k?3kDa; 如果發生糖基化，則產物的遷移宇通常比麥胚提取物或網織紅細胞裂解液翻譯產牛的末修飾的蛋白的遼移率有相對的降低。由于其他原因也對能導致遷移率改變，所以我們可以通過蛋 H 酶保護反說或者蔗糖密度梯度離心來確定
導致遷移率改變的真正原因=堿性蔗糖密度梯度離心能用于確定蛋白是否是否自由存在于內質網腔中或是整合十膜上，而特異的 N-糖基化的抑制可能表現為表面上的分子質量的增加。

1. 蛋白酶保護反應

1) 從轉錄反應體系屮取出 3X10ul 的反應液用于實驗，并置于冰上。假如必須使用少于 10ul 的反應液, 例如當產物要用于多種方法分析時. 可加入 4 倍體積的 1XT 緩沖液+10% 蔗糖對反應液進行稀釋。

2) 向毎個試管中加入 1ul 的 10％TrimnX-100 以裂解存在的膜，并提供一個蛋白質水解酶的陽性對照。

3) 在 10% 的蔗糖溶液屮加入 1ul1/ml 的蛋白酶 K 溶液并同時加人 Triton(二個樣品屮冇一個不添加，以作為加工過程中的穩定性對照）置于冰上 1 h

4) 用 3 倍體積的 10% 蔗糖溶液對 lOOmmol/LPMSF 進行稀釋: 按 1ul/反應的試加入 PMSF，使其終濃度達到 2?2.5 mmol/L，并繼續在冰上孵育 15 min。

5) 加入 lOOul2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠屯泳加樣緩沖液其中包括 1%TntonX-100). 沸水浴 5 min, 如樣品在進行蛋白酶處沔前進行了稀釋，應加入更少體積的 2XSDS 聚丙烯酰胺凝膠屯泳加樣緩沖液，以使最終混合物中提取物的體積不少于 10%。

6)SDS 聚兩烯酰胺凝膠電泳分析 (其中包括-管來自同—反設體系的經相同稀釋的未作處理的樣品. 并將之作為標記物）。

2. 中性蔗糖密度梯度分離

蔗糖密度梯度分離不但可作為分析的工貝. 而旦能對樣品中的翻澤產物作活性分析前的純度分析。

假設按照如下所述的堿性蔗糖密度梯度分離，建議將反應的起始體積設為最少 50ul, 即這樣體積就更容易控制。

1) 于冰上用 10 倍體積的 1XT 緩沖液+10% 蔗糖溶液對樣品進行稀釋. 留一點樣品作為 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的標記物，然后小心的將剩余的部分鋪于盛有 1 ml1XT緩沖液蔗糖溶液的 1.5 ml 離心管中。

2) 于 4℃、40000 g 離心 30 min。

3) 回收頂端包含細胞質蛋白的液層（10% 蔗糖溶液），操作時應避免此液層與 20% 蔗糖溶液層的互溶，以提高產物的純度。移出并棄余下的蔗糖緩沖液，小心不要觸動管底的呈褐色的膜珠。

4) 如果膜的穩定性對于蛋白酶保護反應或堿性蔗糖密度梯度分離等實驗是必需的，則首先用前述蔗糖密度梯度的一半體積的 1XT 緩沖液十 20% 的蔗糖溶液輕輕重懸膜珠，然后分別加入 TritonX-100 和 PMSF 至終濃度為 1%X-100 和 Immol/LPMSF，以溶解膜珠。

5) 通過 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳對總反應產物以及每一組分進行分析.

3. 堿性蔗糖密度梯度分離

堿性處珅可以破壞襄泡膜，釋放放囊泡內的蛋由，但并不溶解脂質雙分子層。在經蔗糖密度梯度分離后，囊泡蛋白將仍留在上清中，而膜結合的組分將以小珠的形式沉淀下來。

1) 取（三）翻譯產物的分析」中的 2 中的「中性蔗糖密度梯度分離」屮的第 4) 步所得的 1OOul 膜溶液，加人等體積的 200 mmol/LNa2C03，置冰上孵育 30 min。

2) 取上步所得的膜 250ul 的 Na2C03 溶液平鋪于盛有 lml20% 蔗糖溶液的 1.5 ml 離心管中，于 4℃ 以 100000 g 離心 1 h

3) 移出 100?150ul 上清，注意：此處允許小部分的損失，不要全部移出。去除 20%的蔗糖溶液后，用 1%TritonX-100,1 mmol/LPMSF 重新溶解膜珠。

4）在進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析前，應加入大約占總體積 10% 的 lmol/L 的HCL 以中和上淸液。注意：HC1 應緩緩加入，井不斷攪拌混勻，以防止局部的蛋白質變件沉淀。另外，在此過程中應不斷用 pH 試紙檢測溶液 pH, 以防 HC1 過量

4. 特異的 N-糖基化抑制

傳統上，位于多肽鏈上的 N-糖基化位點可通過能特異對其進行切割的內切糖苷酶 H 來測這里將介紹一種在策略下完全不同的新方法，通過加入競爭性的 Thr-Tyr-Asn'肽序列可以特異件的抑制非洲爪蟾提取物屮體外翻譯多肽的糖基化，以揭示所翻譯的多肽序列是否進行了 N-糖基化

1) 準備兩組濃度經系列稀釋的二肽水溶液，其濃度范圍為 1.5?50mol/L

2) 在冰上準備好-個至少 80UL 的休外翻譯反應系統，其中應包含用于翻譯成目的蛋白的 mRNTA。

3) 在每 9ul 翻譯反應液中加入 lul 的經系列濃度梯度稀釋的三肽溶液。另外，取一份 9ul 的翻譯反應液加入 1ulDMSO 以代替三肽溶液作為 DMSO 對應應影響的對照。將這些混合物 S 剩余的作為陽性對照的反應物共問于 21℃ 孵育 1 h。然后對樣品進行 SDS 聚內烯酰胺凝膠電泳分析，其中應包括一個經網織紅細胞裂解液翻譯的未糖基化蛋白作為標志物，從電泳結果中應可以看出，被特異抑制的糖基化的蛋比已經糖基化的蛋白泳動速度要快

1) 與任何體外翻譯系統一樣，非洲爪蟾卵母細胞體外翻澤系統也應注意盡量避免其內含物具有 RNase 活性。

2) 不同的雌性爪蟾所排出的卵之間的質量是存在差別的，因此在使用前應對卵的活性進行檢測。檢測卵的受精能力是較為有效的方法。

3) 在極其偶然的情況下，一批卵可能不能很好的裂解。這種情況發生的顯著性標志是，在制備過程中經第一次離心后提取物不是呈琥珀色而是呈灰色. 這種提取物不能很好的進行體外翻評，因此應放棄不用

4) 如用于凍存，應將提取物按 l00ul//管或更少的量分裝到經冰預冷的離心管中，然后置于液氮中 1 min, 冷凍后，提取物最好存于液氮中，但如存于一 70℃ 也可保存其活件數月。

5) 如用凍苻的提取物進行翻譯反應，應避免進行如 T 操作：即在融化的提取物中加入所需的各種試劑. 然后將反應物一分為_并分別進行翻澤反應。因為經這樣操作后，提取物的濃度會被稀釋，這將大大影響其反應活性。

6) 不同的來源和批次的 RNNaseA 的純度是不冋的，因此每一批次使用前應進行滴定，以確定其最適使用濃度。RNNaseA 便用濃度一般為 0.1?5ug/ml, 濃度過低不能去除內源性 RNA 的干擾，而過高則會降解后加入的外源性 mRNA。

7) 在非洲爪蟾卵母細胞體外翻譯系統中，大多數來源于比作洲爪擔更高等的真核生物的 mRNA 時以得到很好的翻譯, 但是原核生物的 mRNA 卻不行。另外，天然的 mRNA 比體外合成的 mRNA 的翻譯效率要高.

8) 用于體外翻譯的 mRNA 的量在很大程度上取決于其來源與活性。通常，體外合成的 mRNA 的用量一般為約 50ug/ml，而poly(A)+mRNA 的用量為 100?200ug/ml, 這個用量并未超出提取物進行體外翻澤后修飾的能力。假如超出此用 1，則分泌性蛋白的有效分泌將會顯著下降，N-糖基化效率將會大幅度降低. 但是，即便使用非常高的 mRNA 的量，也未發現有信號肽末經剪切的情況出現

9) 提取物中的甲硫氨酸的含最大約是 35umol/L(±10%)，因此可以通過 TCA-沉淀反應的產物中 [35S]?甲硫氨酸所占的打分比來估計個反應的蛋白質產景。當用單克隆的 mRNA 進行反應時，產物屮甲硫氨酸的含 t 能被精確的計算得到；但當用 poly(A)1mRNA 時. 甲硫氨酸的含最一般被合砰的估計為 2%。如翻譯反應的￡3 標是盡町能多的獲得蛋白質時，那么我們可以通過添加過量的氨基酸以使蛋白的產量增加約體做法是：向提取物中加入約 5% 體積的包含 700umol/L 的甲硫氨酸和 2 mmol/L 的所有其他各種氨基酸。

10) 作體外翻譯反應中：[35S] 甲硫氨酸常常被使用，這不僅因為它來源方便，而且因為它在提取物中的含量較低，此可產生較好的信號. 但是，當目的蛋白質的甲硫氨酸含極低或是根本不含甲硫氨酸時，可用其他的氨基酸代替甲硫氨酸用于反應。但是，其前提是這些氨基酸要像甲硫氨酸一樣在非洲爪蟾卵母細胞中的含量有限，例如：半胱氨酸、亮氨酸、組氨酸和脯氨酸。

11) 最好在翻譯反應結東時就立即進行蔗糖密度梯度分離反應或蛋白酶保護反應

12) 在蛋白酶保護試驗中，一些信號肽位于胞質屮的穿膜蛋白會因為所添加的蛋白酶 K 的剪切作用而使肽鏈長度有所減少。