黃曲霉毒素介紹及檢測方法

　　黃曲霉毒素主要由黃曲霉菌產生，其他曲霉菌和青霉菌也可產生少許，這些真菌主要寄生于花生、玉米、大米、小麥等谷物及油料。1993年黃曲霉毒素被世界衛生組織(WHO)的癌癥研究機構劃定為1類致癌物，是一種毒性極強的劇毒物質。

　　黃曲霉毒素檢測通用方法

　　薄膜層析法和液相色譜法是目前國內絕大多數檢測機構都在使用的方法。由于其檢測周期長，程序復雜所需試劑繁多等缺點已遠遠不能滿足現代檢測要求.隨著現代科學技術的不斷發展，特別是免疫學生物化學，分子生物學的不斷發展人們已創建了不少快速，簡便特異，敏感低耗且適用的黃曲霉毒素檢測方法.而且以金標試紙為代表的這些方法已經被先進國家所廣泛使用，引進和消化這些先進的方法是我們檢測領域的當務之急.免疫親和柱法優點很多但由于檢測費用過高，而無法普及.而一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法似乎更適用于中國值得推廣。

　　其余檢測方法

　　1、薄層層析法

　　薄層層析(Thin-Layer Chromatography,TLC)是在黃曲霉毒素研究方面應用最廣的分離技術.自1990年它被列為AOAC(Association of Official Agricultural Chemists)標準方法，該方法同時具有定性和定量分析黃曲霉毒素的功能.

　　2，液相色譜法

　　液相色譜(Liquid Chromatography,LC)與薄層層析在許多方面具有相似性二者互相補充.通常用TLC進行前期的條件設定，選擇適宜的分離條件后再用LC進行黃曲霉毒素的定量測定。

　　3，免疫化學分析方法

　　利用具有高度專一性的單克隆抗體或多克隆抗體設計的黃曲霉毒素的免疫分析方法也是最常用的黃曲霉毒素檢測方法.這類方法通常包括放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA)，酶聯免疫法(Enzyme-linked of Immunosorbent Assay,ELISA)和免疫層析法(Immunoaflinity Column Assay,ICA).它們均可以對黃曲霉毒素進行定量測定。

　　(1)免疫親和柱-熒光分光光度法和免疫親和術-HPLC法

　　免疫親和柱法和酶聯免疫吸附法雖然都可達到速簡便效果但酶聯免疫吸附法僅能檢測單一毒素(如黃曲霉毒素B1)含量，而且易出現假陽性結果難以控制.免疫親和柱法(包括熒光光度法和HPLC法)卻能達到既定量準確又快速簡便的要求。

　　免疫親和柱的使用可以避免傳統TLC和HPLC的缺點，同時免疫親和柱與TLC和HPLC法結合可以大大提高工作效率提高靈敏度和準確度。

　　黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法是以單克隆免疫親和柱為分離手段，用熒光計紫外燈作為檢測工具的快速分析方法。它克服了TLC和HPLC法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預處理過程中使用多種有毒，異味的有機溶劑毒害操作人員和污染環境的缺點.同時黃曲霉毒素免疫親和柱-熒光光度計法分析速度快，一個樣品只需10-15min，比傳統方法快幾個小時甚至幾天時間；儀器設備輕便容易攜帶自動化程度高，操作簡單直接讀出測試結果，可以在小型實驗或現場使用.可以進行黃曲霉毒素總量(B1B2G1G2)的測定檢測限可達到1ug/kg，達到黃曲霉毒素標準限量值以下測定范圍為1-300ug/kg。

　　黃曲霉毒素免疫親和柱-高效液相色譜法比傳統的HPLC法更加安全可靠，靈敏度和準確度高。它采用單克隆抗體免疫技術可以特效性地將黃曲霉毒素或其他真菌毒素分離出來，分離效率和回收率高。

　　分析原理試樣中的黃曲霉毒素用一定比例的甲醇/水提取液經過過濾稀釋后，用免疫親和柱凈化以甲醇將親和柱上的黃曲霉毒素淋洗下來，在淋洗液中加入溴溶液衍生以提高測定靈敏度，然后用熒光分光光度計進行定量。也可以將甲醇-黃曲霉毒素淋洗液的一部分注入HPLC中對黃曲霉毒素B1,B2,G1,B2分別進行定量分析.免疫親和柱是用大劑量的黃曲霉毒素單克隆抗體固化在水不溶性的載體上然后裝柱而成.該方法的測定范圍0-300ug/kg。

　　(2)酶聯免疫吸附法：

　　1996年，Nakane建立了辣根過氧化物酶標記抗體的測定技術.由于該方法簡便敏感，特異可作為多種抗原或抗體的測定，20世紀70年代后期該方法引入真菌毒素的檢測中，下面介紹的是競爭性酶聯免疫吸附間接法檢測黃曲霉毒素B1。

　　原理：將已知抗原吸附在固態載體表面洗除末吸附抗原，加入一定量抗體與待測樣品(含有抗原)提取液的混合液競爭培養后，在固相載體表面形成抗原抗體復合物.洗除多余抗體成分然后加入酶標記的抗球蛋白的第二抗體結合物，與吸附在固體表面的抗原抗體結合物相結合再加入酶底物。在酶的催化作用下，底物發生降解反應產生有色物質，通過酶標檢測儀測出酶底物的降解量從而推知被測樣品中的抗原量。

　　(3)微柱篩選法

　　可以用來半定量測定各種食品中黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2的總量。

　　原理樣品提取液中的黃曲霉毒素被微柱管風硅鎂型吸附層吸附后在波長365nm紫外光燈下顯示藍紫色熒光環，其熒光強度與黃曲霉毒素在一定的光密度范圍內成正比例關系.若硅鎂型吸附劑層未出現藍紫色熒光則樣品為陰性(方法靈敏度為5-10ug/kg).由于在微柱上不能分離黃曲霉毒素B1,B2,G1,G2，所以測得結果為總的黃曲霉毒素含量。

　　(4)一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法

　　一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法是利用單克隆抗體而設計的固相免疫分析法。由此產生的一步式黃曲霉毒素快速檢測試紙可在5—10分鐘完成對樣品中黃曲霉毒素的定性測定.借助黃曲霉毒素標準樣品這種方法能估算黃曲霉毒素的含量，非常適用于現場測試和進行大量樣品的初選。