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用小鼠L型成纖維細胞來進行條件優比的，但只需稍做修改即可適用于幾乎任何細胞。根據所研究的細胞類型進行方法優化十分關鍵。實驗材料DNA試劑、試劑盒TBSDMEM葡聚糖DMSOPBS儀器、耗材培養箱離心管實驗步驟1. 接種約5×105小鼠L型成纖維細胞/10 cm培養皿，培養3天至30%~50%匯片。 2. 對每個待轉染培養皿，用乙醇沉淀4 μg 待轉染的質粒DNA，在組織培養櫥中晾干沉淀，重懸于40 μl TBS中。3. 吸去培養液，用10 ml 1×PBS洗滌培養皿，再用4 ml 完全DMEM-10NS洗1次。 4. 將DNA緩慢地（同時不斷晃動試管）加入80 μl 預熱的10 mg/ml DEAE-葡聚糖/TBS中。用200 μl 的移液器逐滴加120 μl DNA/DEAE-葡聚糖至每個培養皿中，使其均勻地覆蓋整個培養皿表面，輕輕旋動使之均勻一致......閱讀全文
實驗概要本文介紹了RNA干擾的原理及基本實驗方法，包括了siRNA的設計、siRNA的制備和siRNA的轉染等方法，及RNA干擾實驗中的注意事項。實驗原理近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因
近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（RNAi）。一、RNA
幾十年來生物學上最重要的進展，也許是關于RNA分子能調節基因表達的發現。RNA干涉（RNAi）是指雙鏈RNA分子使基因表達沉寂的現象，是在線蟲中發現的，在 1998年的一篇Nature論文中被公諸于眾。 此后，科學家們明白，RNAi還有其他形式，它既
RNAi實驗原理與方法近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。這種轉錄后基因沉默機制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被稱為RNA干擾（
步驟包括:(一)siRNA的設計1. 在設計RNAi實驗時，可以先在以下網站進行目標序列的篩選：GenesilAmbion2. RNAi目標序列的選取原則：(1)從轉錄本（mRNA）的AUG起始密碼開始，尋找“AA”二連序列，并記下其3'端的19個堿基序列，作為潛在的siRNA靶位點。有研究
將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種： 1.磷酸鈣共沉淀 將氯化鈣，RNA(或DNA )和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA 且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA 復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉
將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種：1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關
細胞轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術,它是研究基因表達調控，突變分析等的常規工具。細胞轉染分為瞬時轉染和穩定轉染。瞬時轉染是指外源基因進入受體細胞后，存在于游離的載體上，不整合到細胞的染色體上。穩定轉染是指DNA整合到宿主細胞的染色體中。細胞轉染途徑（一） 物理介導：
將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉導至真核細胞中的方法主要有以下幾種： 1.磷酸鈣共沉淀將氯化鈣，RNA(或DNA)和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲進入目的細胞的細胞質。沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉
原核表達系統是常被用來研究基因功能的成熟系統，由于原核表達系統具有包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整等缺陷，人們也開始利用真核細胞表達系統來研究基因。自上世紀70年代基因工程 技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發展，時至今
IS PCR的技術特點 （1）既具有PCR的特異性與高靈敏性，又具有原位雜交的定位準確性；（2）測到低于2個拷貝量的細胞內特定DNA序列，甚至可檢測出單一細胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA；（3）有助于細胞內特定核酸序列定位與其形態學變化的結合分析；（4）可用于正常或惡性細胞，感染或非感染細胞的鑒定
核酸分子雜交技術由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學中最常用的基本技術，被廣泛應用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。雜交的
dsRNA消化法的主要優點在于可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟，為研究人員節省時間和金錢（注意：通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜）。不過這種方法的缺點也很明顯，就是有可能引發非特異的基因沉默，特別是同源或者是密切相關的基因。現在多數的研究顯示 這種情況通常不會造成影