cDNA文庫構建
cDNA文庫[原理]：cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制出第二條DNA鏈（雙鏈）；再進一步把此雙鏈插入原核或真核載體。 l cDNA文庫的構建分為六個階段：階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈階段2：cDNA第二鏈的合成階段3：cDNA的甲基化階段4：接頭或銜接子的連接階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接 [階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈]1．在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：poly(A)+RNA (......閱讀全文
cDNA文庫構建
實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基
cDNA文庫構建
cDNA文庫[原理]：cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建可以：（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；（2）篩選目的基因并直接用于表達；（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。實驗方法原理cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
cDNA－文庫的構建
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶
cDNA－文庫的構建
? ? ? ? ? ? 實驗材料 λ噬菌體臂 大腸桿菌菌株 用于λ噬菌體的包裝抽提物 試劑、試劑盒 放線菌素 D
cDNA－文庫的構建2
階段 3:cDNA 的甲基化 材料 緩沖液和溶液 將貯存液稀釋到合適濃度。 氯仿 10XEcoRⅠ 緩沖液 1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用) 如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。 EDTA(0.5mol/L,pH8.0) 乙醇 MgCl2(
cDNA文庫的構建3
接頭-銜接子與cDNA的連接8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl800~1000 ng 的磷酸化接頭或銜接子 2μlT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1μl10 mmol/L ATP 2μl混勻后，在16℃溫育8~12h。9
cDNA文庫的構建2
10. Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE(pH7.6)溶液進行平衡，然后通過離子柱層析將未摻入的dNTP和 cDNA分開。11. 加入0.1倍體積的3mol/L乙酸鈉（pH5.2）和2倍體積的乙醇，沉淀柱層析洗脫下來的cDNA，將樣品置于冰上至少15分鐘，然后在微量
cDNA文庫的構建1
分為六個階段：階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈階段2：cDNA第二鏈的合成階段3：cDNA的甲基化階段4：接頭或銜接子的連接階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDNA階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接 [階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈] 1.在置于冰上的無菌微
cDNA－文庫的構建3
階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA材料緩沖液和溶液乙醇乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝膠瓊脂糖凝膠（1%)見步驟 8。核酸和寡核苷酸cDNA階段 4 中步
cDNA－文庫的構建（三）
階段 3:cDNA 的甲基化材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿10XEcoRⅠ 緩沖液1XEcoRⅠ 甲基化酶緩沖液（選用)如希望，可替代步驟 1 中的 Tris-HCl,NaCl 和 EDTA。EDTA(0.5mol/L,pH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)NaCl(5mol/L)
cDNA－文庫的構建（一）
實驗材料 λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒 放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶RNase 抑制劑用于 cDNA 合成的寡核苷酸引物poly(A)+RNA[a-32P]dCTPEDTA乙醇(NH4)2SO4β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸T4
cDNA－文庫的構建（四）
方法cDNA 末端的削平1.cDNA樣品（來自步驟 11)于 68°C 加熱5 min。這一步驟是使cDNA分子的單鏈突出端可能形成的雙鏈結構發生變性。2. 將cDNA溶液冷卻至37°C并加入下列試劑：5xT4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
cDNA－文庫的構建（二）
7. 盡可能快地進行 cDNA 合成的下一步驟階段 2:cDNA 第二鏈的合成材料緩沖液和溶液將貯存液稀釋到合適濃度。氯仿EDTA(0.5mol/LpH8.0)乙醇MgCl2(1mol/L)(NH4)2SO4(1mol/L)將 1.3 g 固體硫酸銨溶解于終體積為 10 ml 的水中，溶液經濾膜過濾
cDNA文庫的構建和篩選
材料許多生物是疾病研究或探索使細胞和機體應對和存活于不同刺激下的分子適應機制的優良模型。 cDNA 文庫的構建和隨后目的基因的篩選可促使研究者發現在調節和響應某些外部特定環境壓力中有重要作用，而在其他體系中可能不表達或者不存在的新基因。確定這些新基因的可讀框，進一步分析其編碼蛋白質的功能可以開創全新
cDNA文庫構建技術cDNA鏈的反轉合成
構建cDNA文庫是一種獲得目標基因并進一步進行基因重組,基因克隆的重要方法,而在該文庫構建中有mRNA 逆轉錄出cDNA是一步極為關鍵的操作。mRNA的逆轉錄主要由MMLV、AMV兩種逆轉錄酶催化合成cDNA，在這個逆轉錄過程中，模板mRAN及逆轉錄酶是兩個最重要的影響因素。對于mRNA來講，一
構建cDNA文庫的層析柱cDNA分級
這一步稍不注意會影響成功性或影響獲得的cDNA的片段分布特點。這一步的操作要小心，尤其要在加入cDNA之前通過反復懸浮和試滴保證柱子能正常工作，cDNA的加入和收集要精力集中。獲得的每一級的cDNA量很少，檢測時帶型很暗，所以要用新鮮做的透明薄膠檢測，根據檢測結果一定要舍棄太短的cDNA（一般4
cDNA文庫構建技術cDNA鏈的反轉合成
實驗概要構建cDNA文庫是一種獲得目標基因并進一步進行基因重組，基因克隆的重要方法，而在該文庫構建中有mRNA 逆轉錄出cDNA是一步極為關鍵的操作。mRNA的逆轉錄主要由MMLV、AMV兩種逆轉錄酶催化合成cDNA，在這個逆轉錄過程中，模板mRAN及逆轉錄酶是兩個最重要的影響因素。對于mR
cDNA文庫構建的注意事項
構建全長cDNA文庫分為噬菌體文庫和質粒文庫，二者大同小異。無論怎樣，應當注意如下幾個方面：?一、保證獲得數量足夠的高質量的起始RNA。構建cDNA文庫要求的RNA量比做RACE和Northern blot的要多，在材料允許的情況下一般的試劑盒均推薦采用純化總mRNA后進行反轉錄，這比直接采用總RN
全長cDNA文庫的構建—SMART技術
? ? ? ? 真核細胞的mRNA在加工過程中有一個比喻為“穿鞋戴帽”的過程，因此mRNA的3'末端都帶有一段Poly A，這是利用逆轉錄酶制備cDNA文庫的基礎。但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何獲得全長的cDNA，如何擴增由微量的mRNA逆轉錄得到的cDNA文庫、如何利
RACE技術擴增構建全長cDNA文庫
實驗概要利用RACE(利用PCR技術快速擴增全長mRNA)技術構建全長cDNA文庫是傳統C庫構建技術的改進。本實驗即是利用寡核苷酸帽法，進行全長C庫的構建，從而掌握RACE技術的原理與基本操作方法。實驗原理其原理是利用真核mRNA的3’poly(A)和5’帽子結構作為標簽，用通用引物識別并配對標簽序
構建cDNA文庫的注意事項
噬菌體文庫或質粒文庫均對載體與cDNA的連接效率要求很高，也對連接產物轉染或轉化大腸桿菌的效率要求很高。連接效率高低直接關系到文庫構建是否成功，更要注意的是文庫連接與一般的片段克隆的連接不一樣。一般的片段克隆連接是固定長度的載體與固定長度的目的DNA連接，而文庫連接是固定長度的載體與非固定長度的
基因組文庫和cDNA文庫的構建及篩選
劉芝華 中國醫學科學院腫瘤研究所??分子腫瘤學國家重點實驗室?概念：?基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。???基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構建，基因組序列分析，基因在染色體上
CDNA文庫
?CDNA文庫（主要內容如下）·?????????Construction of cDNA Library·?????????Construction of Genome DNA Library·?????????Library Screening??OthersConstruction of cD
各家cDNA文庫構建試劑盒優缺點比較
Invitrogen的:采用的是Gateway技術：利用λ噬菌體位點特異重組系統的BP和LR雙向反應，首先將PCR產物用傳統方法克隆到Gateway化的入門載體，這個目標基因就可以迅速方便而且定向地重組到任何Gateway化的表達載體上.優點:1無需限制酶切、無需連接，只要利用重組酶就可以穿梭于任何
構建cDNA文庫的反轉錄的注意事項
這是構建cDNA文庫中最貴的一步，也是核酸質變的一步，它將易降解的RNA變成了不易降解的cDNA。反轉錄不成功，說明一次文庫方案的夭折。反轉錄效率不高表現在一是部分mRNA被反轉錄了，但還有相當一部分本該反轉錄的mRNA未被反轉總的全長cDNA太少，這就難以構建好的全長cDNA文庫。少量程度的m
CDNA文庫篩選
CDNA文庫篩選（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L
CDNA文庫篩選
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
cDNA文庫的構建和篩選—在外界環境壓力條件
實驗步驟 一、材料 所有化學試劑均為分子生物學級純度。所用塑料和玻璃制品，包括瓶子和移液器吸頭均經高壓蒸氣滅菌。涉及核酸的操作均需帶手套。 1.總 RNA提取 （1）無 RNase 水。加 I mL 焦 炭 酸 二 乙