PCR實驗技巧1
增加PCR的特異性： 1. prime理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中間序列要多GC,以增加穩定性 d. 避免3'端GC rich, 最后3個ｂａｓｅ不要有GC,或者最后5個有3個不要是GC e. 避免3'端的互補, 否則容易造成DIMER f. 避免3'端的錯配 g. 避免內部形成二級結構 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5'端, 在算Tm值時不算,但在檢測互補和二級結構是要加上它們 i. 使用兼并引物時, 要參考密碼子使用表,注意生物的偏好性,不要在3'端使用......閱讀全文
PCR實驗技巧-1
增加PCR的特異性：? 1. prime理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件 a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量 b. GC% 40%~~~~60%? c. 5'端和中間序列要多GC,以
PCR實驗技巧-5
Trouble shooting guide? 1．假陰性，不出現擴增條帶? PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。? 模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，
PCR實驗技巧-5
Trouble shooting guide?1．假陰性，不出現擴增條帶?PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。?模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染
PCR實驗技巧-3
11. Template DNA preparation?提取DNA時的試劑會抑制PCR反應的順利進行.因此需要對TEMPLATE DNA進行純化.特別是SDS(
PCR實驗技巧-2
5. touchdown PCR?原理很簡單,但的確是一個很有用的方法。舉個例子，ANNEALING TEMP. 55度?94 5min 94 30s 60 30s 72 1min 2cycles 94 30s 59 30s?72 1min 2cycles 94 30s 58 30s 72 1min
PCR實驗技巧-4
④引物的額外序列與退火溫度?若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者GC發夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5'端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環；然
PCR使用技巧
基本PCR引物設計參數?引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。?①引物長度；?
PCR使用技巧
增加PCR的特異性：1. primers design這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些條件a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的引物同樣會降低特異性,并且降低產量b. GC% 40%~~~~60% c. 5&
PCR實用技巧
PCR實用技巧 增加PCR的特異性：? 1. primers design? 這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的 一些條件? a. 足夠長,18-24bp,以保證特異性.當然不是說越長越好,太長的primer同樣會降低特異性,并且降低產量
PCR引物設計技巧
自從1985年美國PE-Cetus公司的人類遺傳研究室 Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應（PCP） 以來，PCR已經成為了分子生物學領域最基本也是最重要的技術手段之一 。然而能否找到一對合適的核苷酸片段作為引物，使其有效地擴增模板DNA序列，無疑決定著PCR的成敗。現在動物遺