DNA測序技術的現狀和發展（七）

3. 新一代測序技術的前景

在2007年6月，James Watson的基因組序列登錄到了GenBank數據庫當中，這是第一次使用非Sanger測序法獲得了人類個體基因組序列，并且第一次將個人基因組序列公之于眾。整個測序過程在兩個月之內就完成了，花費不到100萬美元，這只占耗時10年之久的人類基因組計劃使用經費的千分之一，同時還是2007年5月 在網上公布結果的Venter基因組計劃費用的百分之一。我們比較了454測序儀最初的技術參數（每次可以獲得兩千萬堿基序列，測序長度100bp，準確 率96%）和用于對James Watson進行測序時的技術參數（每次可以獲得一億堿基序列，測序長度250bp，準確率超過99%），結果發現摩爾定律真的適用于基因組測序領域。

454測序儀和其它的新一代測序儀（圖7）一起，展示出了小型化技術和并行處理技術的威力，它們提高了處理通量，降低了測序費用。除了引領新一代測 序技術的發展之外，454公司的研發團隊還開發了體外DNA文庫構建、模板擴增等技術，而且這些技術現在都已經被市場上其它新一代測序儀所廣泛使用。很快，隨著計算機技術的飛速發展，個體基因組測序的費用將會由100,000美元降低到10,000美元，繼而降低到1,000美元甚至更低。個人基因組時代馬上就要到來了!

從費用角度、適用范圍和限制性來說，傳統測序儀和新一代測序儀之間具有明顯的差距。因此，對于每一個具體的項目來說，都需要仔細考慮，選擇出最合適 的測序儀。傳統的Sanger測序法適用于對kb~mb長度的DNA片段進行的小規模的測序項目。Sanger測序法相比新一代測序法而言具有極大的“間隔尺寸（granularity）”，既能用于大型項目也能用于小型項目。雖然與傳統測序儀相比，新一代測序儀在某些方面很明顯地處于劣勢，比如在測序長 度和準確率方面，但即便如此，在處理大規模的測序項目時大家還是傾向于選擇新一代測序儀。

看看新一代測序儀對以往使用傳統測序儀進行的生殖細胞突變和體細胞突變研究的幫助就可以認識到它們的作用有多么強大。在這項研究里，使用 Sanger測序法除了試劑這一項費用之外，其它的費用也遠遠高過了使用其它新一代測序儀。這些其它費用包括在96孔板或384孔板中處理樣品的費用、電泳費用、大量的生物信息學處理費用以及設備維護人工費用等。研究人員最近對100份樣品中的100個基因使用傳統測序方法究竟需要花費多少費用進行了一次非正式的調查，假設每個基因平均由10個外顯子組成，結果發現整體費用在30萬美元至100萬美元不等，價格依據測序單位是非盈利的基因組測序中心還是商 業化的測序服務機構而不同。很顯然，這么高昂的費用對于任何一個實驗室來說都是難以承受的。新一代測序儀除了能將測序費用降低好幾個數量級之外，它們還具 有所需儀器設備少的優點，不過新一代測序儀在后續數據處理方面會碰到問題。

各款新一代測序儀之間也有非常明顯的差異（表10），它們都有各自“拿手”的絕活（表11）。有一些測序項目，比如重測序 （resequencing）對于測序儀的測序長度要求就沒有從頭測序的要求高。對于需要依靠標簽計數（tag counting）的測序項目，例如在定量分析蛋白質與DNA之間的相互作用時，我們就會更加需要能將待測片段分割成盡量多、盡量小片段的測序方法。測序 的準確度和各自相對拿手的項目，比如是善于發現插入、缺失突變還是善于發現堿基替換突變也是需要著重考慮的問題。另外，在進行從頭測序或發現結構性變異的 研究時使用的配對測序法已經廣泛應用于各種新一代測序儀當中。這時，這些配對的模板片段在芯片上的分布情況，比如相互之間的距離遠近等就是需要重點考慮的問題了。

注：DNA測序領域的快速發展使得對各類測序方法的價格及讀長的評估在很短時間內便失去意義。Roche Applied Science、Illumina及Applied Biosystems公司目前都在不斷推出新的產品。表中列出的測序費用只是對使用的反應試劑費用的一個估算。測序長度指的是單鏈長度。

最后，需要考慮的當然是價格因素，各個新一代測序儀的費用都不相同，作為消費者，當然希望各個測序儀生產廠家之間的競爭更加激烈一點。單純比較每個堿基的測序費用是一個不錯的選擇方法，不過有時這也會誤導我們，比如準確率更高的方法當然費用會高一些。

5. 總結

過去幾年間，新一代測序技術獲得了突飛猛進的進展，同時有好幾款使用大規模平行循環芯片測序技術的測序儀得到了廣泛的應用。這幾款測序儀雖然使用的 技術有所差異，但是在測序數據的質量和數量方面都有著同樣的特征，因此也都面臨著同樣的試驗設計、數據分析和注釋的問題。不過，這些新一代測序儀將以往的測序費用降低了好幾個數量級。鑒于此，以前只有大型測序中心才能夠開展的項目，現在在小型實驗室里也能順利進行了。由于新一代測序儀的出現，測序研究領域 也開始升溫，有些研究團隊正在努力開發新的測序技術希望能夠取代現有的新一代測序儀。按照目前的發展速度，我們很難估計幾年之后的情況。不過，能夠預計的 是，下、下一代或者說是第三代測序儀一定會像十年前的芯片技術一樣，迅速地普及開來，從而成為常規的技術。希望人們不僅關注測序技術本身的發展，更加關注 如何利用測序技術來揭開生物學和醫學上的眾多謎團。

原文檢索：
Jay Shendure & Hanlee Ji. (2008) Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology, 26(10):1135-1145.
Jonathan M Rothberg & John H Leamon. (2008) The development and impact of 454 sequencing. Nature Biotechnology, 26(10): 1117-1124.

四、新型納米孔測序技術

新型納米孔測序法（nanopore sequencing）是采用電泳技術，借助電泳驅動單個分子逐一通過納米孔來實現測序的。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，因而可 以在此基礎上使用多種方法來進行高通量檢測。此外，納米級別的孔徑保證了檢測具有良好的持續性，所以測序的準確度非常高。對于長達1,000個堿基的單鏈 DNA分子、RNA分子或者更短的核酸分子而言，根本無需進行擴增或標記就可以使用納米孔測序法進行檢測，這使得便宜、快速地進行DNA測序成為可能。如 果對現有納米孔測序法進行進一步發展和改進，那么它將有望成為第三代測序技術（也可稱為下、下一代測序技術），從而幫助人們實現24小時內只花費 1,000美元完成二倍體哺乳動物基因組測序這一目標。

一個盛滿電解質溶液的容器被一納米孔膜隔成兩半，如果施以比較小的電壓，如約100mV電壓，就能使用標準的電生理檢測手段測量通過納米孔的電流大小。很多生物電通道的開關都是靠小肽段分子是否堵塞通道來實現的。基于這個事實，加州大學圣克魯茲分校（University of California Santa Cruz, UCSC）的Deamer和哈佛大學（Harvard University）的George Church都不約而同地提出一個構想：如果DNA分子或者RNA分子也能堵塞某個通道，那么應該可以運用上述方法來檢測電流。接下來，Deamer和 Branton等人證明了單鏈DNA和RNA分子能通過蛋白質組成的孔道，并且能檢測到它們通過這種納米級孔道時所造成的電流改變（圖8a）。他們使用的孔道蛋白是金黃色葡萄球菌α溶血素（Staphylococcus aureus toxin，α-hemolysin）。這種蛋白以前曾被Bayley小組用作生物傳感器。Bayley小組發現，α溶血素蛋白非常穩定，即使在接近100℃的情況下也能維持正常的功能。Deamer和Branton等人發現，因為α溶血素蛋白孔徑非常小，簡直與單鏈核苷酸的直徑相差無幾，所以可以將 折疊卷曲的核苷酸鏈解開，并僅允許它以單鏈的形式通過蛋白孔道。單鏈核苷酸分子穿過蛋白孔道時會造成局部電流改變，即相比沒有分子穿過時的電流強度有所減 小。基于這個現象，Deamer和Branton等人猜測，如果核酸分子中每一個核苷酸通過孔道時都能出現一種特定形式的電流改變，那么通過分析電流改變 的情況不就能知道核酸的序列了嗎？

為了驗證這個想法，Deamer小組、Meller和Branton小組使用好幾種不同的RNA分子和單鏈DNA分子進行了研究，以觀察它們對電流 的影響。結果發現，polyC RNA分子引起的電流強度下降比polyA RNA分子要強得多。此外，他們還發現，由30個A和70個C組成的RNA分子在序列從A轉變成C時電流強度也會發生改變。不過不幸的是，這種嘌呤和嘧啶之間的明顯差異沒能在脫氧核糖核苷酸試驗中發現。實際上，在RNA試驗中觀察到的polyA和polyC引起不同形式的電流改變是由堿基堆積（base stacking）和二級結構上的差異造成的。隨后，使用不同DNA同聚物（DNA homopolymer）進行試驗發現，脫氧嘌呤寡聚物（deoxypurine oligomer）和脫氧嘧啶寡聚物（deoxypyrimidine oligomer）引起的電流改變差別并不大，只有不足5%。而且這種電流改變差異是由10~15個核苷酸（占據了α溶血素蛋白的跨膜區）引起的，它無法 區別單個核苷酸引起的電流改變之間的差異（圖8a）。