實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
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| 儀器、耗材 | |
| 實驗 步驟 | 一、篩選目的基因片段的參數 1. 序列 ( 1 ) 構建一個指定的 RNA 沉默載體首先要進行生物信息學分析。根據目的基因對應的已知 cDNA 序列或預測的基因序列設計引物，用反轉錄-PCR ( RT- PCR) 方法擴增 cDNA 上的一部分序列。如果沒有目的基因的基因組序列，可以用其他物種中基因的序列去搜索已知序列的 cDNA。如果目的基因是多基因家族的成員，就需要與家族成員進行多重比較以指導 PCR 引物的設計。要擴增的基因區域以及它與其他基因的相似性決定了該 RNAi 載體靶向單個 mRNA 還是多個相關基因的轉錄產物。 ( 2 ) 擴增編碼區和非編碼區（UTR ) 都能獲得好的沉默效果。由于沉默機制依靠序列同源性，因此相關的 mRNA 序列有可能被交叉沉默。如果沒有特殊要求，應選擇與其他序列同源性較低的序列，如 5' 或 3' UTR。為減少交叉沉默，應避免選擇與目的基因以外的序列有大于 20 個堿基一致性的區段構建載體。 ( 3 ) 目前已經有標準的軟件能幫助檢測序列同源性，以精確、系統地評估并最大限度地減少 siRNA 序列和目的基因之間 RNAi 脫靶情況的發生[ 45 ] (見注6 ) 。 ( 4 ) 除了基因的編碼區以外，截短的啟動子表達的 dsRNA 也能誘導基因抑制。這種方式誘導轉錄水平基因沉默（TGS) [46, 47]。 2. 大小 范圍在 50~1000 bp 之內的基因片段已經被成功地用作基因沉默的靶標。正確選擇片段長度時需要考慮兩個因素：片段越短，則沉默的頻度越低； 發夾越長，在細菌寄主中發生重組的概率越大。為了達到最優化的沉默效率，我們推薦使用 300~600 bp 片段長度。 二、RNAi 發夾 RNA 載體（hpRNA ) 的產生 構建 hpRNA 的方法有多種。可以利用標準的植物轉化載體進行構建，這種方法需要將每個目的基因對應的發夾編碼結構都重新構建到載體上。另外，可以使用通用的基因沉默載體，如由 CSIRO ( 澳大利亞）開發的用于谷物轉化的 pStarling 和 pStargate 系列載體（http ://www . pi. csiro. au/RNAi/vectors.htm ) 。只需要通過傳統的克隆 ( pStarling) 方法或使用 Gateway定向重組系統（pStargate) 將目的基因的 PCR 衍生物克隆到上述載體即可。 1. 克隆與目的 mRNA 同源的 cDNA 片段 ( 1 ) RT-PCR 實驗中使用的引物需要添加 BamH I 和 Bgl Ⅱ 限制酶酶切位點，用來擴增與目的基因序列一致的、300~600 bp 的片段。BamH I 和 Bgl Ⅱ 作為同尾酶，二者酶切產生的片段末端彼此兼容。該操作保證基因片段能被有方向性地克隆到 PAHC7 載體唯一的 BamH l 位點 [17]。 ( 2 ) 內含子片段的克隆策略與上述目的基因的克隆策略相同。 ( 3 ) PCR 擴增所采用的程序：94°C 變性 45 s、62°C 退火 45 s、72°C 延伸 90 min，共擴增 35 個循環。 ( 4 ) 以 cDNA 片段為模板擴增的產物經如 BamH I 和 Bgl Ⅱ 酶切后被克隆到 PAHC17 質粒的及 BamH I 特異性限制位點（見注 7 和圖 12. 3) 。 ( 5 ) 反向重復序列組裝完成后即可克隆到合適的雙元載體上，用于農桿菌介導的植物轉化。 2. pSTARLING 載體 ( 1 ) 如果將多個目的基因逐一進行沉默將是一件很費力的工作。研究發現 pSTAR-LING 系統轉化效率非常高，并且適用于同時沉默少量幾個基因。  ( 2 ) 該載體采用玉米泛素啟動子驅動發夾 RNAi 產物在單子葉植物中高水平地組成性表達。 ( 3 ) 用傳統的限制酶酶切和 DNA 連接技術可將 PCR 片段插入到載體上，反向片段插入到 BamH I Pad I Asc I 多克隆位點，正向片段插入到 SpeI SnaBI KpnI 多克隆位點。 3. pSTARGATE 載體 ( 1 ) 該載體可以作為另外一種高通量載體 pSTARLING 的替代產品，采用了商品化可用的 Gateway 克隆系統（http : // www . Invitrogen . com ) , 能沉默大量的基因（如一個基因家族成員或一個通路的成員）。 ( 2 ) 該載體也能實現方向性克隆。該體系含有的陰性選擇標記（ccdB）能篩選掉無重組反應的載體，并高效地獲得重組質粒。 ( 3 ) pSTARGATE 載體包含兩個重組盒，在反向重復鏡像中包含 attP1-ccdB-attP2 或 attR1-ccdB-attR2，因此當基因片段側翼含有合適的 att 位點時能與載體發成重組產生 ihpRNA 編碼的結構。 4. 構建的質粒載體的鑒定 ( 1 ) 將擴增的所有 cDNA 片段亞克隆到 pGEM-T 載體。 ( 2 ) 連接產物轉化 E.coli，并篩選具有氨芐抗性的克隆，用少量細菌培養液提取質粒 DNA，用限制酶酶切圖譜鑒定重組質粒。 ( 3 ) 為確定克隆的 DNA 片段正確，每一個最終的載體都需要進行 DNA 測序。因為在大工程中存在一個潛在的問題，即大量 cDNA 片段可能被平行克隆并且發生混合。 ( 4 ) 每個構建均要進行完整的反向序列片段測序，并將產生的序列和目的基因序列比對之后才能最終確定。 5. 沉默表型的檢測 ( 1 ) 不同的 hpRNA 轉基因株系因為干擾效果的不同會產生一系列程度不同的缺陷表型 [22 , 48 ]。 ( 2 ) 由于 RNAi 干擾效果有很大的不同（微弱、中等、強），靶 mRNA 的水平變化可以從與野生型一致到完全檢測不到（見注 8) 。 三、VIGS 1. VIGS 接種技術 ( 1 ) BSMV 基因組中每一種轉錄產物（野生型的或經過遺傳改造的）以 1 : 1 : 1 比例混合，并加入接種緩沖液 FES [49]。 ( 2 ) 將混合物摩擦接種于生長 7 天的植物。戴上手套后，吸取混合物放置于并攏的拇指和食指中間。 ( 3 ) 用另一只手握住植物的基部，用戴手套的食指和拇指輕輕擠壓第一葉和第二葉。 ( 4 ) 并攏的手指輕輕地從基部到尖部滑動兩次之后，整個葉片表面均涂滿混合物。 2. 用 BSMV 沉默內源的大麥或小麥/基因 ( 1 ) 將野生型 BSMV 質粒、βRNA 質粒、不攜帶植物序列的（BSMV: 00 ) 或含有片段的 γRNA 衍生物質粒的體外轉錄產物以 1:1:1 比例混合接種于溫室生長的大麥和小麥幼苗。 ( 2 ) 用 BSMV- PDS 摩擦接種生長 7 天的幼苗的第一葉和第二葉，7 天后，大麥的第三葉和第四葉首次出現明顯的白化癥狀。在小麥中白化現象也發生，但要到病毒接種第 10 天以后才可見（ 見注9 和注 10)。 3. 用 BSMV-VIGS 方法鑒定 R 基因介導的抗病通路中所需要的基因 BSMV 侵染后啟動 VIGS，而病原菌侵染后啟動植物抗性系統。通常二者存在必要的時間間隔且間隔時間一般是8 天。 四、目的基因 mRNA 下調檢測 1. 實時定量 PCR ( 1 ) 為了確定 RNA 誘導的外源基因是否影響目的基因的 mRNA 水平，采用兩對引物進行定量 RT- PCR 檢測。一對引物是特異性地針對目的基因 mRNA 而設計的，用于檢測有效的內源 mRNA 水平而非外源基因的轉錄產物水平。 ( 2 ) 第二對引物擴增與靶標 RNA 沉默無關的一個內參基因，如被用作內參的甘油醛-3- 磷酸脫氫酶基因（GAPDH，AF251217）。 ( 3 ) 為驗證試驗可重復性，每個 RNA 樣品進行三個重復（ 三個 cDNA) 。 ( 4 ) 可以用 ABI PRISM 7700 序列檢測系統（ Applied Biosystems) 及 SYBR GreenPCR 檢測混合物 （ Applied Biosystems) 進行實時 PCR 檢測。在終體積 26 μl 的反應體系中加入 cDNA 模板以及合適的引物。擴增條件：50°C，2 min；95℃，10 min；95°C，15s、60°C，1 min，40 個循環。 2. 小干擾 RNA 檢測 ( 1 ) 用看家基因 GAPDH（AF251217，甘油醛-3- 磷酸脫氫酶）作為對照進行雜交。 ( 2 ) 轉基因植物與野生型植物中雜交信號的相對強度可以用磷屏（ phosphoimager) ( Cyclone gene array system, Perkin- Elmer, Boston) 檢測。 |
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