雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳由O'Farrel以及Klose和Scheele等人于1975年發明的，原理是第1向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，具有相同等電點的蛋白質無論其分子大小，在電場的作用下都會用聚焦在某一特定位置即等電點處；第2向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。......閱讀全文
雙向凝膠電泳技術的技術應用
凝膠中蛋白的檢測凝膠染色的目的是使其中的蛋白質能夠被觀察到。目前還沒有通用的染色方法，只能在考慮多種因素如需要的靈敏度、線性范圍、方便程度、費用、以及成像設備類型等基礎上，結合實際進行選擇。有時也可以將蛋白轉膜后通過免疫印跡的方法來進行檢測。圖像采集和分析成像設備可以攝人圖像，對凝膠圖像以數字形式保
雙向凝膠電泳的基本原理
1、根據蛋白質的等電點（第一向）和分子量（第二向）的不同進行分離。2、電泳后根據蛋白質的上樣量對膠進行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色，然后用相關軟件對電泳圖象進行分析。
雙向凝膠電泳實驗常見問題分析
(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上，但當前的技術還不足以檢出拷貝數低于1000的蛋白質。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（>200kD）或極小（
雙向凝膠電泳技術的操作步驟
樣品要求1、建議使用的蛋白質溶解體系為8M尿素/4%CHAPS /40mMTris（Base）/65mM DTT；2、樣品濃度大于2 μg/ μl；樣品制備雙向電泳成功的關鍵在于建立一套有效的、可重復的樣品制備方法。樣品制備的影響因素包括蛋白質的溶解性、分子量、電荷數及等電點等。對于不同的樣品性質及
雙向凝膠電泳技術的技術缺陷
(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上，但當前的技術還不足以檢出拷貝數低于1000的蛋白質。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（>200kD）或極小（
雙向凝膠電泳技術的修飾和加工
蛋白質的翻譯后修飾和加工，是指在肽鏈合成完成后進行的化學反應，如磷酸化、羥基化、糖基化、二硫鍵形成，以及目前發現的蛋白質自剪接等等，可能有一百種以上。翻譯后修飾和加工對蛋白質的正常生理功能是必需的，它們的變化往往和疾病的發生有關。用雙向凝膠電泳可以進行翻譯后修飾的研究，如用32P標記可以研究磷酸
雙向凝膠電泳試驗樣品制備的相關介紹
雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。 雙向電泳成功的關鍵在于建立一套有效的、可重復的樣品制備方法。樣品制備的影響
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗 方案2 雙向凝膠電泳真核生物細胞裂解物的制備實驗 方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗 方案5 第一向：蛋白質的等電聚焦電泳實驗
雙向凝膠電泳法在蛋白鑒定的應用
一旦通過差異分析或其它方法找到感興趣的蛋白后．就可以從凝膠中或膜上切取這些目標蛋白質作鑒定。現在絕大多數蛋白質的鑒定是通過質譜分析來完成的。
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗實驗方法原理可用乙醇沉淀人類腦脊液以濃縮其中的蛋白質和除去鹽分，否則這些物質會干擾第一向?IEF。實驗材料人類腦脊液試劑、試劑盒乙醇NaOH增溶溶液β-巰基乙醇儀器、耗材離心管冷凍離心機超聲波儀實驗步驟1.在室溫下解凍腦脊液樣品。當樣品解凍后，旋緊試管蓋，
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
實驗方法原理 肝與其他動物組織一樣，可制備用作雙向電泳的材料。離心之后，溶于合適的溶液中即可。不需要濃縮蛋白質或去除干擾物質等額外步驟。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采堿去垢劑ASB-14，它們配合使用可最大量地溶解蛋白質。實驗材料 鼠肝試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇（DTT)抽提溶液苯甲基硫酰
雙向凝膠電泳的等電聚焦相關介紹
蛋白質是兩性分子，在不同的pH環境中可以帶正電荷、負電荷或不帶電荷。對每個蛋白質來說都有一個特定的pH，此時蛋白質的靜電荷為零，此pH值即該蛋白質的等電點(pI)。將蛋白質樣品加載至pH梯度介質上進行電泳時，它會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質子，并且隨著
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗3
方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 實驗方法原理 細菌裂解液含大量核酸，在進行雙向凝膠電泳之前，需先對核酸進行處理。可通過超聲波處理包含脲和 CHAPS 的細菌提取液。當脲存在時，核酸酶（Benzonase) 是有活性的，但是其活性依賴于 Mg2+。核酸酶處理后加入 ED
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗10
方案11 銀氨染色 實驗方法原理 銀染聚丙烯酰胺凝膠首先由 Switzer 等引進（1979)，已迅速成為一種最普遍使用的高靈敏度蛋白質染色方法。因存在背景高、重復性不好及銀鏡等問題，多年來對此方法的改進較多。目前，Rabilloud 等（1994b）在文獻中發現 100 多種不同
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗14
方案14 雙向凝膠的槽式轉移實驗 實驗材料 包含蛋白質樣品的凝膠 試劑、試劑盒 轉移緩沖液 儀器、耗材 印跡紙硝化纖維素薄膜或 PVDF 膜電源電泳轉移設備 實驗步驟 1.測量 SDS-PAGE 凝膠的尺寸，將轉移膜剪成與凝膠相適應的尺寸。 槽
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗16
方案16?用麗春紅 S 染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜的蛋白質 試劑、試劑盒 麗春紅乙酸 實驗步驟 1.用麗春紅 S 染液浸沒轉移后的膜，輕搖 5 min。 2.棄去染液，用水清洗膜，重復幾次，直到蛋白質條帶變得清晰。 不要重復使用染料，因為這可能使結
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗17
方案17 用考馬斯亮藍 R250 染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜的蛋白質 試劑、試劑盒 考馬斯亮藍 R250甲醇乙酸 實驗步驟 1.將轉移后的膜浸在考馬斯亮藍染液中，輕搖 5min?。 2.棄去染液，在搖床上用含乙酸的甲醇進行脫色。不要重復使用染液，因為
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗18
方案18 用印度墨水染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜蛋白 試劑、試劑盒 印度墨水PBS吐溫-20溶液 實驗步驟 1.將膜浸人吐溫-20 溶液中，輕搖 10 min。 2.棄去吐溫-20 溶液。 3.重復步驟1與2三次。 4.將膜轉人印度墨水中，輕搖染色
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗1
方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗實驗方法原理肝與其他動物組織一樣，可制備用作雙向電泳的材料。離心之后，溶于合適的溶液中即可。不需要濃縮蛋白質或去除干擾物質等額外步驟。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采堿去垢劑ASB-14，它們配合使用可最大量地溶解蛋白質。實驗材料鼠肝試劑、試劑
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗15
方案15 雙向凝膠的半干印跡實驗實驗方法原理當 “ 三明治”結構中的濾紙浸透緩沖液時，半干印跡轉移設備能將蛋白質從凝膠轉移到膜上。和槽式印跡轉移設備相比，半干印跡只用較少的緩沖液；因為電極板靠得很近，故轉移時只要求較低的電壓。實驗材料含有蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒轉移緩沖液儀器、耗材印跡紙支持性纖
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗6
方案6 垂直 SDS 平板凝膠的制備：均一凝膠的灌制實驗實驗方法原理蛋白質通過 IEF 進行分離之后，可進行第二向電泳，即 SDS-PAGE。本方案詳細介紹了灌制均一 SDS-PAGE 凝膠的方法。均一凝膠（具完全相同的%T和％c) 對特殊分子量范圍的蛋白質有較好的分離效果，因其灌制方法簡單而被普遍
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗13
方案13 用 GelCode 磷蛋白染色試劑盒對磷蛋白進行染色實驗實驗材料含蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒乙酸鉬酸銨溶液含硝酸的鉬酸銨溶液甲基綠溶液NaOH磺基水楊酸溶液含氯化鈣的磺基水楊酸溶液儀器、耗材帶有蓋子的玻璃或塑料平皿烘箱往復式或定軌式搖床實驗步驟1.將凝膠放入盛有 50 ml 水的平皿中，
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗19
方案19 用膠體金染色膜上的蛋白質實驗材料轉膜蛋白試劑、試劑盒膠體金染液PBS (PH 7. 2)吐溫-20溶液實驗步驟1.將膜浸入吐溫-20 溶液中，37°C，輕搖 45 min。2.室溫下，用吐溫-20 溶液洗膜，輕搖 5 min。3.棄去洗液，多次重復步驟①和②。4.室溫下在膠體金染液中染膜
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗11
方案11 與質譜兼容的銀染法實驗實驗方法原理在方案 11 中介紹的銀氨方法是用于檢測在 SDS-PAGE 凝膠上蛋白質的最靈敏的方法之一。但是，這種方法和其他標準銀染方法都不適合于質譜分析，而質譜已成為鑒定雙向凝膠上蛋白質的最好方法。因為在凝膠中被質譜分析的蛋白質不能被修飾，許多通常用的敏化試劑（例
雙向凝膠電泳技術應用于蛋白鑒定
一旦通過差異分析或其它方法找到感興趣的蛋白后．就可以從凝膠中或膜上切取這些目標蛋白質作鑒定。現在絕大多數蛋白質的鑒定是通過質譜分析來完成的。
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗7
方案7 垂直SDS 平板凝膠制備：同時灌制多梯度凝膠實驗實驗方法原理對于分離寬分子量范圍的蛋白質，梯度 SDS-PAGE 凝膠可提供最佳分析方法，產生更清晰的蛋白質點。通過減少凝膠中孔的尺寸，可使擴散減少。但是，梯度凝膠重復性較差，所以通常用多凝膠灌制裝置來同時灌制，制作一套凝膠來進行同一系列的實驗
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗12
方案12 用 SYPRO Ruby 進行熒光染色實驗材料含蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒固定液SYPRO Ruby 染料儀器、耗材聚丙烯塑料平皿往復式或定軌式搖床UV或藍光透射儀實驗步驟1.將膠放入聚丙烯塑料平皿中，其中應有足夠的固定溶液，使凝膠在平皿中能自由漂浮。在搖床上搖動 30 min。如果是多
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗9
方案9 膠體考馬斯亮藍染色實驗暫未評分點評實驗，有機會獲丁當獎勵?+收藏固相化 pH 梯度雙向凝膠電泳實驗標簽：雙向凝膠電泳蛋白質 固相化pH 蛋白質與蛋白質組學實驗指南 第四章雙向電泳是研究蛋白質組學的一種有效方法。與單向電泳相比，它能從復雜的蛋白質混合物中分離出更多的成分。電泳時，蛋白質遷移速度
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗5
方案5 第一向：蛋白質的等電聚焦電泳實驗實驗方法原理這里所描述的分離蛋白質的兩種方法都是基于蛋白質所帶凈電荷的多少，使用固相化的 pH 梯度凝膠進行的 IEF 技術。這些方法作為雙向凝膠分離的第一向，除了利用傳統的水平電泳儀進行 IPG 凝膠的等電聚焦外（方案 5 方法 A)，還能在自帶的電泳槽里使
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗8
方案8 第二向：蛋白質的 SDS-PAGE 實驗實驗方法原理在第一向 IEF 和 IPG 膠條平衡之后，需進行第二向 SDS-PAGE。SDS-PAGE 是基于蛋白質分子量的不同而將其分離的。這種分離系統可從多家供應商處獲得，在許多蛋白質化學實驗室中也普遍使用。這里介紹放置 IPG 膠條的方法以及第