雙向凝膠電泳實驗常見問題分析
(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上，但當前的技術還不足以檢出拷貝數低于1000的蛋白質。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（>200kD）或極小（<10kD=蛋白的分離）。(4)難溶蛋白的檢測，這類蛋白中包括一些重要的膜蛋白。(5)得到高質量的雙向凝膠電泳需要精湛的技術，因此迫切需要自動二維電泳儀的出現。......閱讀全文
雙向凝膠電泳實驗常見問題分析
(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上，但當前的技術還不足以檢出拷貝數低于1000的蛋白質。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（>200kD）或極小（
雙向瓊脂糖凝膠電泳實驗
【實驗目的】了解和掌握雙向電泳技術,并學習用它來研究與DNA 復制相關的問題.【實驗原理】DNA 分子有線狀的,還有一些非線狀的,如復制叉和重組DNA 結構.雙向瓊脂糖凝膠電泳技術就是被人們開發用以研究一些非線狀DNA 分子的.雙向瓊脂糖凝膠電泳技術(2-D gel)實際上可分為兩類：中性/
雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳由O'Farrel以及Klose和Scheele等人于1975年發明的，原理是第1向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，具有相同等電點的蛋白質無論其分子大小，在電場的作用下都會用聚焦在某一特定位置即等電點處；第2向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白
雙向凝膠電泳的圖像采集和分析
成像設備可以攝人圖像，對凝膠圖像以數字形式保存，對每塊凝膠圖像進行平等的比較，在各研究組之間傳遞信息，并對大量的數據進行歸類分析。目前應用較為廣泛的圖像分析軟件有PDQuest、ImageMaster 2D Elite、Melanie、BioImage Investigator等，分辨率較高，功
雙向凝膠電泳原理
1、根據蛋白質的等電點（第一向）和分子量（第二向）的不同進行分離。2、電泳后根據蛋白質的上樣量對膠進行考馬斯亮蘭染色、銀染或熒光染色，然后用相關軟件對電泳圖象進行分析。
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗 方案2 雙向凝膠電泳真核生物細胞裂解物的制備實驗 方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗 方案5 第一向：蛋白質的等電聚焦電泳實驗
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
方案4 雙向凝膠電泳腦脊液蛋白樣品的制備實驗實驗方法原理可用乙醇沉淀人類腦脊液以濃縮其中的蛋白質和除去鹽分，否則這些物質會干擾第一向?IEF。實驗材料人類腦脊液試劑、試劑盒乙醇NaOH增溶溶液β-巰基乙醇儀器、耗材離心管冷凍離心機超聲波儀實驗步驟1.在室溫下解凍腦脊液樣品。當樣品解凍后，旋緊試管蓋，
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗
實驗方法原理 肝與其他動物組織一樣，可制備用作雙向電泳的材料。離心之后，溶于合適的溶液中即可。不需要濃縮蛋白質或去除干擾物質等額外步驟。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采堿去垢劑ASB-14，它們配合使用可最大量地溶解蛋白質。實驗材料 鼠肝試劑、試劑盒 二硫蘇糖醇（DTT)抽提溶液苯甲基硫酰
凝膠電泳常見問題分析
要跑瓊脂糖凝膠電泳， 5ng 就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？ 參考見解：5ng 已經可以了，但是或許20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內呈線性。 把210bp的pcr產物進行酶切,得到190+20bp的兩個片段,請問能用瓊脂糖凝
凝膠電泳常見問題分析
1、要跑瓊脂糖凝膠電泳，5ng就能很清楚的跑出來，是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？ 參考見解 ： 5ng已經可以了，但是或許20ng～200ng效果好，在此范圍內呈線性。 2、把210bp的PCR產物進行酶切，
凝膠電泳常見問題分析
要跑瓊脂糖凝膠電泳， 5ng 就能很清楚的跑出來是這樣嗎？能夠照相的清楚的條帶，至少需要多少量呢？參考見解：5ng 已經可以了，但是或許20ng50ng-200ng效果好，在此范圍內呈線性。把210bp的pcr產物進行酶切,得到190+20bp的兩個片段,請問能用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果嗎?用多大
雙向凝膠電泳存在問題
(1)低拷貝蛋白的鑒定。人體的微量蛋白往往還是重要的調節蛋白。除增加雙向凝膠電泳靈敏度的方法外，最有希望的還是把介質輔助的激光解吸/離子化質譜用到PVDF膜上，但當前的技術還不足以檢出拷貝數低于1000的蛋白質。(2)極酸或極堿蛋白的分離。(3)極大（>200kD）或極小（
雙向凝膠電泳的作用
雙向凝膠電泳由O'Farrel以及Klose和Scheele等人于1975年發明的，原理是第1向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，具有相同等電點的蛋白質無論其分子大小，在電場的作用下都會用聚焦在某一特定位置即等電點處；第2向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白
雙向凝膠電泳技術
雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。分離蛋白質組所有蛋白的兩個關鍵參數是其分辨率和可重復性。在目前情況下，雙向凝膠電泳
雙向凝膠電泳技術
雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。 分離蛋白質組所有蛋白的兩個關鍵參數是其分辨率和可重復性。在目前情況下，
雙向凝膠電泳技術
雙向凝膠電泳的原理是第一向基于蛋白質的等電點不同用等電聚焦分離，第二向則按分子量的不同用SDS-PAGE分離，把復雜蛋白混合物中的蛋白質在二維平面上分開。近年來經過多方面改進已成為研究蛋白質組的最有使用價值的核心方法。 分離蛋白質組所有蛋白的兩個關鍵參數是其分辨率和可重復性。在目前情況下，
雙向凝膠電泳操作步驟
樣品要求1、建議使用的蛋白質溶解體系為8M尿素/4%CHAPS /40mMTris（Base）/65mM DTT；2、樣品濃度大于2 μg/ μl；樣品制備雙向電泳成功的關鍵在于建立一套有效的、可重復的樣品制備方法。樣品制備的影響因素包括蛋白質的溶解性、分子量、電荷數及等電點等。對于不同的樣品性質及
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗3
方案3 雙向凝膠電泳大腸桿菌裂解液的制備實驗 實驗方法原理 細菌裂解液含大量核酸，在進行雙向凝膠電泳之前，需先對核酸進行處理。可通過超聲波處理包含脲和 CHAPS 的細菌提取液。當脲存在時，核酸酶（Benzonase) 是有活性的，但是其活性依賴于 Mg2+。核酸酶處理后加入 ED
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗10
方案11 銀氨染色 實驗方法原理 銀染聚丙烯酰胺凝膠首先由 Switzer 等引進（1979)，已迅速成為一種最普遍使用的高靈敏度蛋白質染色方法。因存在背景高、重復性不好及銀鏡等問題，多年來對此方法的改進較多。目前，Rabilloud 等（1994b）在文獻中發現 100 多種不同
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗14
方案14 雙向凝膠的槽式轉移實驗 實驗材料 包含蛋白質樣品的凝膠 試劑、試劑盒 轉移緩沖液 儀器、耗材 印跡紙硝化纖維素薄膜或 PVDF 膜電源電泳轉移設備 實驗步驟 1.測量 SDS-PAGE 凝膠的尺寸，將轉移膜剪成與凝膠相適應的尺寸。 槽
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗16
方案16?用麗春紅 S 染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜的蛋白質 試劑、試劑盒 麗春紅乙酸 實驗步驟 1.用麗春紅 S 染液浸沒轉移后的膜，輕搖 5 min。 2.棄去染液，用水清洗膜，重復幾次，直到蛋白質條帶變得清晰。 不要重復使用染料，因為這可能使結
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗17
方案17 用考馬斯亮藍 R250 染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜的蛋白質 試劑、試劑盒 考馬斯亮藍 R250甲醇乙酸 實驗步驟 1.將轉移后的膜浸在考馬斯亮藍染液中，輕搖 5min?。 2.棄去染液，在搖床上用含乙酸的甲醇進行脫色。不要重復使用染液，因為
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗18
方案18 用印度墨水染色膜上的蛋白質 實驗材料 轉膜蛋白 試劑、試劑盒 印度墨水PBS吐溫-20溶液 實驗步驟 1.將膜浸人吐溫-20 溶液中，輕搖 10 min。 2.棄去吐溫-20 溶液。 3.重復步驟1與2三次。 4.將膜轉人印度墨水中，輕搖染色
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗1
方案1 雙向凝膠電泳鼠肝蛋白質提取物的制備實驗實驗方法原理肝與其他動物組織一樣，可制備用作雙向電泳的材料。離心之后，溶于合適的溶液中即可。不需要濃縮蛋白質或去除干擾物質等額外步驟。所用抽提溶液包括脲、硫脲和酰胺烷基硫代甜采堿去垢劑ASB-14，它們配合使用可最大量地溶解蛋白質。實驗材料鼠肝試劑、試劑
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗15
方案15 雙向凝膠的半干印跡實驗實驗方法原理當 “ 三明治”結構中的濾紙浸透緩沖液時，半干印跡轉移設備能將蛋白質從凝膠轉移到膜上。和槽式印跡轉移設備相比，半干印跡只用較少的緩沖液；因為電極板靠得很近，故轉移時只要求較低的電壓。實驗材料含有蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒轉移緩沖液儀器、耗材印跡紙支持性纖
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗6
方案6 垂直 SDS 平板凝膠的制備：均一凝膠的灌制實驗實驗方法原理蛋白質通過 IEF 進行分離之后，可進行第二向電泳，即 SDS-PAGE。本方案詳細介紹了灌制均一 SDS-PAGE 凝膠的方法。均一凝膠（具完全相同的%T和％c) 對特殊分子量范圍的蛋白質有較好的分離效果，因其灌制方法簡單而被普遍
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗13
方案13 用 GelCode 磷蛋白染色試劑盒對磷蛋白進行染色實驗實驗材料含蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒乙酸鉬酸銨溶液含硝酸的鉬酸銨溶液甲基綠溶液NaOH磺基水楊酸溶液含氯化鈣的磺基水楊酸溶液儀器、耗材帶有蓋子的玻璃或塑料平皿烘箱往復式或定軌式搖床實驗步驟1.將凝膠放入盛有 50 ml 水的平皿中，
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗19
方案19 用膠體金染色膜上的蛋白質實驗材料轉膜蛋白試劑、試劑盒膠體金染液PBS (PH 7. 2)吐溫-20溶液實驗步驟1.將膜浸入吐溫-20 溶液中，37°C，輕搖 45 min。2.室溫下，用吐溫-20 溶液洗膜，輕搖 5 min。3.棄去洗液，多次重復步驟①和②。4.室溫下在膠體金染液中染膜
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗11
方案11 與質譜兼容的銀染法實驗實驗方法原理在方案 11 中介紹的銀氨方法是用于檢測在 SDS-PAGE 凝膠上蛋白質的最靈敏的方法之一。但是，這種方法和其他標準銀染方法都不適合于質譜分析，而質譜已成為鑒定雙向凝膠上蛋白質的最好方法。因為在凝膠中被質譜分析的蛋白質不能被修飾，許多通常用的敏化試劑（例
固相化－pH－梯度雙向凝膠電泳實驗12
方案12 用 SYPRO Ruby 進行熒光染色實驗材料含蛋白質樣品的凝膠試劑、試劑盒固定液SYPRO Ruby 染料儀器、耗材聚丙烯塑料平皿往復式或定軌式搖床UV或藍光透射儀實驗步驟1.將膠放入聚丙烯塑料平皿中，其中應有足夠的固定溶液，使凝膠在平皿中能自由漂浮。在搖床上搖動 30 min。如果是多