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最近在做原核表達，包涵體。以前也做過，但經驗不多。一點失敗的教訓以及純化過程中的體會，貼出來與大家共享，同時希望得到同行們的指正1. 首先介紹一下背景。載體是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是該公司的BL21 star DE3，是一個蛋白降解酶突變菌株，也就是說是一種優化表達菌株。2. 第一次失敗。第一次做誘導的時候，重復了很多次，但總是誘導不出來。PCR，酶切都正確。但沒等測序結果出來就開始做了。失敗了。曾在園子求助。后來證明是引物錯誤。我們實驗室合成引物都要先發給purchasing office，然后才由他們與公司交涉。這個office的老太太把引物弄掉了一個堿基。教訓：在實驗過程中，再仔細都是不為過的。引物來了后管壁上貼有序列，但我忽略了。3. 第二次失敗。后來重新構建，轉化，誘導。第一次誘導時根本就沒帶。見附圖（圖片質量太差了，sorry，下面幾個帖會逐漸好轉。我們都在失敗中提高，進步，不是嗎）......閱讀全文
最近在做原核表達，包涵體。以前也做過，但經驗不多。一點失敗的教訓以及純化過程中的體會，貼出來與大家共享，同時希望得到同行們的指正1. 首先介紹一下背景。載體是invitrogen公司的pET22b，Amp抗性。菌株是該公司的BL21 star DE3，是一個蛋白降解酶突變菌株，也就是說是一種優化表達
將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之
基因克隆技術 實驗方法原理 一個完整的表達系統通常包括配套的表達載體和表達菌株。如果是特殊的誘導
實驗概要本實驗介紹了原核表達的具體操作流程，包括：外源基因的誘導表達，大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化。實驗原理1. E. coli 表達系統E. coli 是重要的原核表達體系。在重組基因轉化入E. coli 菌株以后，通過溫度的控制，誘導其在宿主菌內表達目的蛋白質，將表達樣品進行SDS-PAGE
重組蛋白真核表達采用原核表達系統進行研究，主要方法是將已克隆到目的基因DNA的片段的載體轉化到細菌中，通過IPTG誘導和終純化獲得所需的目的蛋白。其優點是可以在短時間內獲得基因表達產物，所需成本相對較低。 目前的表達系統各有利弊，但一般理想的表達系統滿足以下幾點：一是特異性，不受其他
1. 了解實驗課題對目的蛋白的要求包括：目的蛋白分子量有多大，表達目的（是蛋白結晶、藥劑結合還是制備抗體，不同目的對蛋白要求不同）；是否要其可溶；是胞內表達還是分泌表達，是組成型表達還是誘導型表達；另外，還要了解蛋白表達后需要采用什么樣的方式進行純化，純化標簽有多大，蛋白純化后是否需要將標簽去除（即
表達不同于其它一些實驗，比如：提取質粒、PCR 、電鏡切片，這些人為控制的因素比較多，出問題相對來說也比較好分析。表達呢，你把質粒克隆好啦，交給細胞，然后有些事情就不全是你要怎樣就怎樣了。原核表達在表達當中來說還是比較簡單，細菌培養條件簡單、生長速度快，需要的儀器和培
實驗概要將克隆化基因插入合適載體后導入大腸桿菌用于表達大量蛋白質的方法一般稱為原核表達。這種方法在蛋白純化、定位及功能分析等方面都有應用。大腸桿菌用于表達重組蛋白有以下特點：易于生長和控制；用于細菌培養的材料不及哺乳動物細胞系統的材料昂貴；有各種各樣的大腸桿菌菌株及與之匹配的具各種特性的質粒可供選擇
檢測原核表達蛋白不需要將菌體超聲波破碎的如果是僅僅檢測原核蛋白是否有表達，可以直接將菌體重懸于蒸餾水中，并使用SDS-PAGE的方法檢測。如果需要檢測原核蛋白是否有可溶表達，則需要將菌體超聲波破碎之后再檢測是否有可溶表達。所以檢測原核表達蛋白不需要將菌體超聲波破碎的
你想用信號肽把蛋白表達到哪里呢?細胞沒有核膜,缺少細胞器通常做細胞內表達不需要信號肽的定位作用多余的信號肽不能被細胞識別切除有可能影響蛋白質的正確折疊從而產生一系列問題