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1．電轉化感受態細胞的制備1. 用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）2. 37℃，220rpm，培養14-16個小時。3. 第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中，37度，220rpm，振搖2-3小時，每半小時測一次OD，當OD值達到0.3-0.4時，停止培養。4. 將菌液在冰上預冷30分鐘，隨后將菌液分裝到500ml 預冷的離心杯中，4℃，2500rpm離心10分鐘。5. 棄上清，離心杯中加入少量ddH2O，使沉淀懸浮后，再將......閱讀全文
1．電轉化感受態細胞的制備 1.????? 用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照） 2.????? 37℃，220rpm，培養14-16個小時。 3.????? 第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml L
2．檢測：（PCR方法）取適量PCR薄壁管，置于冰上，按以下體系依次加入：各試劑均加好后，離心機上甩一下，使之沉底，置于PCR儀上待 PCR反應進入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR產物加入3ul溴芬蘭跑電泳，同時上1Kb DNA ladder半小時后照相，觀察膠圖：insert、vector
2．pBlueScriptII的雙酶切消化 1．以如下體系進行EcoRI酶切： pBSK(+) X μl（6μg） ddH2O 174-X μl 10×Buffer E 20 μl 混勻，加入限制性內切酶： EcoRI （10U/ μl） 6 μl 總體積為200 μl。 2．輕彈
4EcoRIadaptor加接: 1.往雙鏈 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀; 2.溶解完成后,順序加入下列試劑: 1.2ul 10×Ligase Buffer 1ul 10mMrATP 1ul T4DNA Lig
三．cDNA雙鏈合成 1.SupersciptII —RT合成第一鏈: 1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入 xul mRNA(大約500ng) 1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul) (5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTT
二.mRNA的分離 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 準備工作： 1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解 Oligotex.,然后置于室溫。 2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。
(二)動物組織totalRNA的提取 1．根據表1選擇適當的組織量和相應的變性裂解液量，將變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。 2．將組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細胞碎片。 3．根據表1加入適量2M的乙酸鈉（pH
一.Total RNA的提取 (一) 試劑配制 準備工作： 1.研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內,180℃，烤6小時。 2.50ml/1.5ml離心管
1．試劑及配方： 2 x LB （1升）： ??????? 20g??? 氯化鈉 ??????? 20g??? 蛋白提取物 ??????? 10g??? 酵母提取物 ????? 加入蒸餾水至1升，用NaOH調pH值至7.0，高壓滅菌 2 x LB－甘油（12.5%）（200ml） 1
1. Superscipt II—RT合成第一鏈: 1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入 ???????? xul?? mRNA(大約500ng) ???????? 1ul?? Xho I Primer(1.4ug/ul) ?????????? (5’ GAGAGA