聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（一）
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟：(1) 變性(Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過氫鍵配對；(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最適溫度下，以目的DNA為模板進行合成。由這三個基本步驟組成一輪循環，理論上每一輪循環將使目的DNA擴增一倍，這些經合成產生的DNA又可作為下一輪循環的模板，所以經25-35輪循環就可使DNA擴增達106 倍。一、 PCR反應中的主要成份1、引物：PCR反應產物的特異性由一對上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR成敗的關鍵。引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則：(1) 引物長度約為16-30bp， 太短會降低退火溫度影響引物......閱讀全文
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（一）
PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟：(1) 變性(Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
概 述? PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上
聚合酶鏈式反應（PCR）擴增和擴增產物克隆
?PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟：(1) 變性(Denature)：目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈；(2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆
第一節 概 述?PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈反應)是一種選擇性體外擴增DNA或RNA的方法.它包括三個基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA片段在94℃下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當溫度(50℃
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（三）
材料、設備及試劑一、材料不同來源的模板DNA。二、設備移液器及吸頭，硅烷化的PCR小管，DNA擴增儀(PE公司)，瓊脂糖凝膠電泳所需設備(電泳槽及電泳儀)，臺式高速離心機。三、試劑：1、10×PCR反應緩沖液：500mmol/L KCl， 100mmol/L Tris·Cl， 在25℃下， pH9.
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（二）
二、PCR反應參數1、變性：在第一輪循環前，在94℃下變性5-10min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈，然后加入Taq DNA聚合酶(hot start)，這樣可減少聚合酶在低溫下仍有活性從而延伸非特異性配對的引物與模板復合物所造成的錯誤。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA
聚合酶鏈式反應(PCR)擴增和擴增產物克隆（四）
[注意]1、純化樹脂在使用前必須充分混勻。 2、PCR產物中礦物油應盡量吸去，否則會影響提取DNA的 產量。四、載體加dT尾1、將1μg pUC19用SmaⅠ全酶切。 2、在小管中按上述PCR反應，加入各種混合物，除將4μl 4種dNTP改為4μl 25mM dTTP。 3、加入1μl(
PCR擴增產物的克隆
實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Str
PCR擴增產物的克隆
?PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。平端連接法實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30
PCR擴增產物的克隆
平端連接法 TA克隆法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；P