PCR產物克隆
克隆方法：1. 平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3''突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。在采用大量T4DNA連接酶并配以5-10u T4 RNA連接酶時，可顯著提高其連接效率。對于較短PCR產物，用PUS19的HincⅡ位點進行克隆，以X－gal和IPTG篩選，常可得到足量重組子。另一種提高克隆效率的途徑是先用Klenow大片段或T4DNA聚合酶消去3''末端突出堿基將PCR產物變成平端DNA，然后再用平端連接法克隆PCR產物。 2. 粘端連接 引物中設計入限制酶位點：由于PCR引物的5''末端可以增加一些非互補堿基，因此可以在兩引物的5'&#......閱讀全文
PCR產物克隆
克隆方法：1. 平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3''突出一個堿基的DNA分子。這種DN
PCR產物克隆
PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切與連接法，雜交法和近期開發出來的特異性重組法等。但因為TA克隆法操作最簡單，快速和高效的原因，成為Taq聚合酶PCR產物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen發明，并擁有全球TA Cloning商標的ZL權。TA克隆方法（Original TA Cl
PCR產物克隆
克隆方法：1. 平端連接? 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'''&#
PCR產物的克隆
?PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。?? 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR產物的克隆
PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR 產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR 產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求
PCR產物的克隆
PCR?產物的克隆?PCR?產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。??? 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的?PCR?產物直接進行連接。載體可用EcoR V?或?Sma I?切成平頭；?PCR?產物純化后，可以在?22?℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶
PCR產物克隆方法
平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條 DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由
PCR產物的TA克隆
TA克隆 系統可以用于快速地、一步到位地把PCR 產物直接插入到質粒載體的多克隆 位點（MCS）中。實驗方法原理PCR產物克隆大致分為兩類，即平頭連接和粘頭連接。平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR 產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR 產物純化后，可以在2
PCR產物的TA克隆
實驗概要本實驗介紹了DNA回收和連接的基本原理，PCR產物的T-vector克隆。實驗原理1. DNA片段回收方法：DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片
PCR產物的TA克隆
實驗原理DNA片段回收方法：DNA片段在適當濃度的瓊脂糖凝膠中，通上一定電壓進行電泳，不同大小的DNA分子由于遷移率的不同而分離開。切下帶有所需DNA片段的凝膠，用凍融法、玻璃奶回收法或商品化膠回收試劑盒將目的片段回收純化。2. 利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體
PCR技術（十）：PCR產物克隆方法
平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效 率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能 在兩6條DNA鏈的3'末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為 3'突出一個堿基的DNA分子。這種DNA分子的連接效率很低。由于PCR
PCR產物的平末端克隆
靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯
克隆PCR產物的最優條件
最佳插入片段： 載體比需實驗確定，4：1(插入片段：載體)常為最佳比，摩爾數比1：8 或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5μL2X連接液，50ng質粒DNA，1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10μL。室溫保溫1h，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫
PCR產物的平末端克隆
常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 與 Schwartz (1992) 發現在連接反應的溫育過程中，當反應液中存在過量的限制性內切核酸酶能顯著地增加重組質粒的產率
PCR擴增產物的克隆
實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用該酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR產物也可不加處理。如果使用Str
PCR產物的平末端克隆
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 靶基因經 PCR 擴增，樣品進行必要的純化回收后，接下來用平末端進行連接克隆也是分子生物學實驗中常規采用的技術路線，實驗一般利用噬菌體 T4 DNA 聚合酶等補平擴增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuan
PCR擴增產物的克隆
平端連接法 TA克隆法 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；P
PCR產物的T載體克隆
（一）重組T質粒的構建一．原理外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的 DNA分子是在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統中，將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種：T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌
PCR擴增產物的克隆
?PCR擴增產物的克隆可以：（1）獲得目的DNA片段；（2）用于原核表達的研究；（3）廣泛應用于分子生物學相關研究。平端連接法實驗方法原理平頭連接是將制備好的平頭載體和補平或削平的PCR產物直接進行連接。載體可用EcoR V或Sma I切成平頭；PCR產物純化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30
詳細介紹PCR產物克隆方法
克隆方法： 1. 平端連接 通常情況下，PCR產物可直接與平端載體DNA進行連接，但其連接效率效低。因為TaqDNA聚合酶具有非模板依賴性末端轉移酶活性，能在兩6條DNA鏈的3''末端加上一個多余的堿基，使合成的PCR產物成為3''突出一個堿基的DNA分子。這
PCR擴增產物的克隆——TA克隆法
實驗方法原理TA克隆 系統由Invitrogen公司（San Diego，CA）發展而來的商業性試劑盒，它用于PCR 產物的克隆 和測序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR 產物的3'末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3'T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位
制備克隆用PCR產物的純化
PCR 產物經酚:氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法純化后，DNA 樣品內還往往殘留了一些具有酶活性的 Taq DNA 酶與另外一些熱穩定 DNA 聚合酶（Cioweetal. 1991; Bamesl992)。這些殘余的 DNA 聚合酶連同一些殘余的 dNTP 的持續存在，常常妨礙有待進一步克隆
如何提高PCR產物克隆的效率
把PCR產物克隆到載體上常見有3種做法：?1. ?直接克隆到T載體（或者U載體上）?2. ?引物設計時引入酶切位點，PCR產物酶切后直接克隆到目標載體上?3. ?將平末端PCR產物直接克隆到平末端酶切載體上。?方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，NewEngland
制備克隆用PCR產物的純化
實驗方法原理 PCR 產物經酚:氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法純化后，DNA 樣品內還往往殘留了一些具有酶活性的 Taq DNA 酶與另外一些熱穩定 DNA 聚合酶（Cioweetal. 1991; Bamesl992)。這些殘余的 DNA 聚合酶連同一些殘余的 dNTP 的持續存
制備克隆用PCR產物的純化
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 PCR 產物經酚:氯仿抽提、乙醇沉淀及其他一些常用方法純化后，DNA 樣品內還往往殘留了一些具有酶活性的 Taq DNA 酶與另外一些熱穩定 DNA 聚合酶（Cioweetal. 1991; Bamesl992)。這些殘余的
如何提高PCR產物克隆的效率
把PCR產物克隆到載體上常見有3種做法：1.直接克隆到T載體（或者U載體上）2.引物設計時引入酶切位點，PCR產物酶切后直接克隆到目標載體上3.將平末端PCR產物直接克隆到平末端酶切載體上。??? 方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，New England Biol
如何提高PCR產物克隆的效率
把PCR產物克隆到載體上常見有3種做法：1.直接克隆到T載體（或者U載體上）2.引物設計時引入酶切位點，PCR產物酶切后直接克隆到目標載體上3.將平末端PCR產物直接克隆到平末端酶切載體上。??? 方法3主要是針對高保真的聚合酶比如Stratagene公司的Pfu酶，New England Biol
PCR擴增產物克隆的實驗要點
引物設計主要是要注意以下幾個事項： （1）發夾結構； （2）反向配對； （3）GC含量（40－60%）； （4）退火溫度（45－65度）； （5）引物長度（18－27bp）； （6）3' 端最好是C、G（提高結合度）； （7）引物在序列中的錯配位點。 大致就這幾個方面，重要性
克隆PCR產物的最優條件是什么？
最佳插入片段:載體比需實驗確定。1:1(插入片段:載體)常為最佳比,摩爾數比1:8或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液, 50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑。室溫保溫1
克隆PCR產物的最優條件是什么？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液，50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶，插入片段共10ul。室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺T-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫