小鼠βactin基因的克隆表達（1）
動物組織RNA的提取實驗目的：掌握由動物組織中提取總RNA的方法實驗原理：Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA則分布在上層的水相中，最后用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，這樣就可以得到比較純凈的總RNA.實驗步驟：① 先在研缽中加入液氮，再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，用液氮預冷的藥匙取50～100mg組織粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意組織粉末總體積不能超過所用Trizol體積的10%），充分混合均勻。② 室溫放置5min，然后加入200μl的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15秒鐘。③ 12000rpm離心10min，取上層水相于一新的EP管中（千萬不要將中間的沉淀層和下層液混入，否則重新離心分離），加入......閱讀全文
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十五）
? LB固體培養基????????? Tryptone????????????? 1g????????? Yeast Extract?????????? 0.5g????????? NaCl???????????????? 1g? Agar???????????????? 1.5g? 加蒸餾水至總體
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions:????? 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH?? Buffer B (200ml
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十六）
Amp(50mg/ml)??????? 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養基，1:1000比例稀釋?????? ????? Kan(50mg/ml)??????? 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆-蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十二）
– Note: The yield of fusion protein can be estimated by measuring the ? absorbance at 280 nm. The GST affinity tag can be approximated by 1 A280 ? 0.5
Gateway技術：克隆、表達新方法
Gateway技術提供以下可能： 通過去除冗長的亞克隆步驟節省您的時間?同時將您的基因轉移到多個表達系統?在任何您選擇的系統――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達一、一種更好的克隆方法Gateway技術能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統（圖1）。這項強大的體外技術大大地簡化了基
分子克隆-蛋白表達實驗指南（四）
7. PCR產物與TA載體連接?? pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation ? efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.? +A s
分子克隆-蛋白表達實驗指南（六）
10. 測序? 突變后氨基酸序列沒有變化仍可用于表達。測序報告中blast時若有‘－’符號，則人工對照測序圖譜。? 測序驗證后沒有突變或者同義突變的重組質粒必須小抽，50ul，conc300ug/ml備份。測序文件應妥善保存，蛋白表達完成后一并提交存檔。? 獲得GS后，即可構建含GE的重組T載體，用
Gateway技術：克隆、表達新方法
Gateway技術提供以下可能： 通過去除冗長的亞克隆步驟節省您的時間同時將您的基因轉移到多個表達系統在任何您選擇的系統――體外，細菌，酵母，昆蟲，或哺乳動物――分析表達一、一種更好的克隆方法Gateway技術能夠克隆一個或多個基因進入到任何蛋白表達系統（圖1）。這項強大的體外技術大大地簡化了基因克