小鼠βactin基因的克隆表達（1）
動物組織RNA的提取實驗目的：掌握由動物組織中提取總RNA的方法實驗原理：Trizol試劑是一個包含酚、異硫氰酸胍和SDS的單相酸性溶液，其在裂解細胞的同時抑制RNase的活性，隨后加入氯仿，酚會大量的溶解在氯仿中。由于DNA和RNA在酸性酚中的溶解性不同，造成DNA分布在下層的氯仿酚溶液中，RNA則分布在上層的水相中，最后用異丙醇沉淀水相中的RNA，并用70%乙醇洗滌沉淀，這樣就可以得到比較純凈的總RNA.實驗步驟：① 先在研缽中加入液氮，再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，用液氮預冷的藥匙取50～100mg組織粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意組織粉末總體積不能超過所用Trizol體積的10%），充分混合均勻。② 室溫放置5min，然后加入200μl的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15秒鐘。③ 12000rpm離心10min，取上層水相于一新的EP管中（千萬不要將中間的沉淀層和下層液混入，否則重新離心分離），加入......閱讀全文
有關融合蛋白表達載體的克隆
在構建融含蛋白表達載體時除了要注意插入片段的方向、讀碼框架與載體保持一致外，注意以下問題可能會減少一些不必要的麻煩，當外源片的插入載體起始密碼的后面，另一個基因的前面時，注意檢查插入后基因的兩端是否引入了新的終止密碼，特別是用到Klenow mung bean 核酸酶，T4 Polymerase
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十六）
Amp(50mg/ml)??????? 溶解1g Amp于足量的水中，最后定容至20ml。分裝成小份于-20℃貯存。常以20～50ug/ml的終濃度添加于生長培養基，1:1000比例稀釋?????? ????? Kan(50mg/ml)??????? 溶解1g Kan于足量的水中，最后定容至20ml
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十七）
Buffers for His purification in denatured conditions:????? 配制時加終體積50％的水，之后定容至所需體積。先配pH 8.0的buffer(調pH需要較多NaOH)，再統一配bufferC，D，E，分別調pH?? Buffer B (200ml
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十八）
15％膠????????? ??????? 水1.11.872.33.43.854.65.76.99.211.5??????? 30％聚丙烯酰胺混合液2.54.2557.58.751012.5152025??????? 1.5M Tris(pH=8.8)1.32.212.53.84.5556.37.
分子克隆-蛋白表達實驗指南（三）
若有非特異性條帶，可進行Touchdown PCR，提高引物的特異性。???? PCR反應條件：??????????? 1????? 94C???? 5min??????????? 2????? 94C???? 45s??????????? 3????? 65C???? 45s????? 退火溫度視
分子克隆-蛋白表達實驗指南（四）
7. PCR產物與TA載體連接?? pGEM-T vector is T-tailed at the insert site. To improve the ligation ? efficiency, it is recommended PCR product be A-tailed.? +A s
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十三）
7．? ? 電泳結束后，按比例從膠上割下相應約1cm條帶（當按比例的條帶割下后可相應的向兩邊再割一點，但是電透析時中間和兩邊的膠必須分開透析），用鑷子或尺子將膠碾碎成2mm見方的小塊。? 8．? 將碎塊小心加入電透析tube中，200V，120～150min。? 9．? 移出放電透析tube的架子，
分子克隆-蛋白表達實驗指南（二）
取DEPC水時切記帶上手套?? ? Genequant使用方法：? 開機－set-up－enter(只更改DNA/RNA，看光波是否為320nm)－set-ref(此時插入空白對照)－樣品? 1．使用前將比色皿中水吸出，用1ml蒸餾水重新洗滌再將比色皿中的水吸盡（先用1ml槍吸，后用100ul槍吸）
分子克隆-蛋白表達實驗指南（十四）
RbCl制備感受態細胞? 需準備的滅菌器具和培養液：? SOB，Buffer 1，Buffer 2，3×200ml廣口瓶，1.5ml ? EP管，1×500ml離心瓶（按200ml搖菌量計算），2×50ml離心管，2×移液管（用于加Buffer 1），液氮，冰? 離心管，EP管，移液管使用前均需要放
小鼠β-actin基因的克隆表達（4）
實驗步驟：（1）誘導靶蛋白表達分別挑取對照菌和重組菌1~2個菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養過夜。取5ml過夜培養物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培養液，37℃振蕩培養2h以上，至對數中期（A550=0.5~1.0）。向誘導管中加入IPTG使其濃