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1.凝膠的預處理交聯葡聚糖凝膠的市售商品多為干燥顆粒，使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5～10倍的去離子水中，參照相關資料中凝膠溶脹所需時間，進行充分浸泡，然后用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒，并減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡，準備裝柱。在許多情況下，也可采用加熱煮沸方法進行凝膠溶脹，此法不僅能加快溶脹速率，而且能除去凝膠中污染的細菌，同時排除氣泡。2.裝柱層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25～100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4～10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生“器壁效應”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5～1︰25；對于純化蛋白質來說應為1︰20～1︰100。凝膠柱的裝填......閱讀全文
羥基磷灰石 (hydroxyapatite,HA) 是一種以磷酸鈣為原料的羥基化物, 其大量地用于蛋白質的層析分離主要是在 1991?2009 年，并且最初只是用于重組蛋白的純化。HA 的使用方法參照 Tiselius 等（1956) 的論述和 Gorbunoff(1985) 的綜述。實驗步驟一、機
實驗步驟 一、機制 從 1971 年（Bernardi，1971;Gorbunoff，1990) 就已經幵始定期發表關于 HA 對蛋白質吸附與解吸附的綜述。最近的一篇文獻 (Kandorietal.，2004) 引用了較早闡述的
一、原理1.葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素DE5
一、原理1.葡聚糖凝膠Sephadex G-200凝膠柱層析 利用大分子不能進入凝膠顆粒內部 最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）2.利用離子交換法，選取DEAE-陰離子纖維素
基 本 方 案 可 溶 性 或 膜 結 合 抗 原 的 分 離材 料抗 體（Ab)-Sepharose (單兀 12. 2)活 化 的（對照）Sepharose填料，用于制 備 A b -Sepharose填 料（單 元 12. 2)，但去除了抗體或偶聯時用無關抗體替代細胞或勻漿的組織T S A 溶
詳細闡述利用親和層析分離蛋白質的過程，進行蛋白質分析時，需將此規模縮小至微量離心管中進行免疫沉淀過程，對于單一的蛋白質或由相同亞基組成的蛋白質，經單向凝膠電泳后檢測到單一的 蛋 白 質 條 帶對熒光染色法進行了闡述，它主要用于磷蛋白和糖蛋白的檢測。為了確定蛋白質是否是特異性抗原，可采用相對應的抗體進
實驗概要本實驗利用葡聚糖凝膠柱層析對PPO粗酶液進行了純化。實驗原理1. 葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，凝膠層析法能將不同分子大小的物質分離開。(G-200能分離800-80000D分子量
操作采用分子篩層析獲得的洗脫圖譜如圖 23.1 A 所 75。零 洗 脫 體 積 (zero elution volu m e ) 是指上樣于層析固定相的樣品體積。無法進入介質的分子的洗脫體積定義為無效體 積 V 。，它表示顆粒外部的體積。可以進人介質的分子的體積定義為總體積％, 它表示
凝膠層析法脫鹽和分離蛋白質（附凝膠過濾法原理及基本操作）-3（2）裝柱將層析劑裝入柱中進行層析的方法稱柱層析法。作層析用的柱子稱層析柱。層析柱有玻璃和透明塑料的兩種。柱子的一端為進口，另一端為出口，出口端底部有燒結玻璃砂板或尼龍布，能阻止層析劑流出，溶劑則可流過。如果沒有市售的層析柱，可以選用粗細均
蛋白質純化的層析技術中，凝膠過濾比較獨特,它是基于蛋白質分子質量的相對大小而分離。與傳統的過濾相反，通過凝膠過濾柱后,并沒有任何蛋白質留存于其中。凝膠過濾優缺點明顯;優點在于，脆性蛋白質與層析固定相結合并不會破壞其功能;缺點在于,和凝膠不結合則限制層析的分辨率。作者： 伯吉斯等,主譯：陳薇，本實驗來
實驗步驟 操作 采用分子篩層析獲得的洗脫圖譜如圖 23.1 A 所 75。零 洗 脫 體 積 (zero elution volu m e ) 是指上樣于層析固定相的樣品體積。無法進入介質的分子的洗脫體積定義為無效體 積 V
5. 正相色譜與反相色譜 正相色譜是指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子移動的速度快，先從柱中流出來。 反相色譜是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子移動的速度快而先從柱中流出。&
選擇合適的緩沖液可以有助于保持目標蛋白質的完整性，同時利于其吸附于 HA。這一步驟在平衡時最好已經完成，平衡時應該沒有任何的磷酸鹽，然后加載緩沖液。但是在經過幾個循環后，填充柱便失效了。研究表明，低至 2rmnol/L 的磷酸鹽可以延長層析柱的壽命，同時又兼顧目標蛋白質的純度。磷酸鹽與 ME
凝膠層析法 實驗方法原理 葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒
凝膠過濾層析法 實驗方法原理 凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中
實驗方法原理 凝膠過濾層析是根據蛋白質分子大小不同而達到分離效果的，凝膠過濾填料中含有大量微孔，只允許緩沖液及小分子量蛋白質通過，而大分子蛋白質及一些蛋白復合物則被阻擋在外。因此，高分子量的蛋白質在填料顆粒間隙中流動，比低分于量蛋白更早地被洗脫下來。最大的蛋白質分子最早流出柱子，因為它們在到達柱底前
（3）在開始收集洗脫液的同時檢查蛋白質是否已開始流出。為此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中，加入1滴20%磺基水楊酸，若呈現白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質出現，直到檢查不出白色沉淀時，停止收集洗脫液。（4）由經檢查含有蛋白質的每管中，取1滴溶液，放置在白色比色盤孔中，加入1滴奈氏試劑，若
凝膠過濾層析是一項重要的蛋白質純化技術，又稱為大小排阻、凝膠排阻、分子篩或凝膠過濾層析這種方法利用分級分離，而不需要蛋白質的化學結合，這就明顯降低了因不可逆結合所致的蛋白質損失和失活。另外，可利用此法更換蛋白質的緩沖液或降低緩沖液的離子強度。在蛋白質純化操作中何時使用凝膠過濾，還不能一概而論，有時純
五、生產規模層析柱的填裝對于填充良好的大規模層析柱, 從其頂端到底端，其中的填料是連續均勻分布的，并表現為最佳的層析效能。CHT 的填裝方法有數種，如何選擇取決于所用的層析柱類型及設備。在填裝層析柱前, 應參閱層析柱、介質轉移設備和介質填裝設備的相關指導手冊。開放性層析柱的最大填充床高度不能高于介質
實驗方法原理葡聚糖凝膠SephadexG-200凝膠柱層析利用大分子不能進入凝膠顆粒內部最先流出柱外，而小分子物質進入凝膠顆粒內部，流速慢而最后流出柱外，將不同分子大小的物質分離開。（G-200能分離800-80000D分子量的蛋白質）。實驗材料PPO粗酶液試劑、試劑盒Tris-HCL緩沖液NaCL
葡聚糖具有較強的親水性，在水和電解質溶液中膨脹成為柔軟而富于彈性的凝膠，其吸水能力與葡聚糖凝膠的交聯度有密切關系。交聯度大的，孔徑小，吸水少，膨脹的程度小；交聯度小的，孔徑大，吸水多，膨脹的程度大。因此，葡聚糖凝膠孔徑的大小可以其吸水量的大小來表示，常以G–10至G–200號碼標記。G后面的數字是其
一、紙層析紙層析創立于1944年，和薄層層析一樣，紙層析不僅可以用來分離、檢識、測定中藥中復雜的有效成分，而且可以于少量成分的提取精制。它是一種以濾紙上吸附的水為固定相，濾紙作為支持劑的分配層析法。紙層析應用較廣，其主要用途是為分配薄層及分配柱層析摸索條件。雖然紙層析比較費時，易產生拖尾、不耐腐蝕性
實驗方法原理 可進行離子交換的蛋白質在實驗條件下必須有單一電荷。溶液中單一電荷的蛋白質可被離子交換樹脂上的小離子置換（指與蛋白質末端離子的交換）；固定在樹脂上。通過提高溶液中相反離子濃度或降低蛋白質所帶電荷數等方法可將蛋白質從樹脂上洗脫下來。利用此法，可根據不同蛋白質電荷性質不同而將其分離開來。若已
五、離子交換層析柱的操作以下是離子交換層析柱操作的一般性步驟。此外還需要一些專用步驟以確保離子交換劑在使用時保持穩定。這些步驟如下：’(1) 加載鹽溶液；(2) 平衡層析柱；(3) 蛋白質上樣；(4) 洗去未結合物質；(5) 洗脫；(6) 再生；(7) 消毒處理。一般操作條件如表 22.2 所 TK
試劑、試劑盒 無菌的過濾水 乙腈 乙酸銨 正丁醇 不含指示染料的甲酰胺凝膠加樣緩沖液
試劑、試劑盒 無菌的過濾水乙腈乙酸銨正丁醇不含指示染料的甲酰胺凝膠加樣緩沖液甲酰胺指示染料混合液甲醇：水溶液寡核苷酸洗脫緩沖液TE 溶液合成寡核苷酸粗制品儀器、耗材 MillexHV 濾器石蠟封口膜或熒光薄層層析板Sep-Pak 傳統層析柱注射器紫外燈水浴加熱器實驗步驟 材料緩沖液和溶液稀釋緩存液至
離子交換層析法 實驗方法原理 可進行離子交換的蛋白質在實驗條件下必須有單一電荷。溶液中單一電荷的蛋
柱層析的基本裝置及基本操作目前，最常用的層析類型是各種柱層析，下面就簡述柱層析的基本裝置及操作方法，薄層層析的裝置和操作將在后面詳細討論。(1)柱層析的基本裝置柱層析的基本裝置，如圖2－21 。(2)柱層析的基本操作柱層析的基本操作包括以下一些步驟：①裝柱柱子裝的質量好與差，是柱層析法能否成功分離純
離子交換層析在純化蛋白質的層析手段中使用最為廣泛。它對蛋白質的分辨率高，操作簡易，重復性好，成本低。按照離子交換原理，蛋白質可從大量緩沖性溶液中被分離，所以此方法尤適于蛋白質粗提物的初始純化。在分離蛋白質時，速度往往是很重要的。 如蛋白酶的初始分離和不穩定蛋白質的純化。離子交換層析提供了很多加速分離
實驗材料用于質譜分析的蛋白質或多肽樣品試劑、試劑盒乙腈（HPLC級）甲醇基質溶液三氟乙酸儀器、耗材平頭鑷子GELoader 移液吸頭MALDI-MS板移液吸頭Poros R1、Poros R2 或 Oligo R3 層析樹脂注射器實驗步驟1.將 GELoader 移液吸頭的尖端壓扁。圖 8.32 所