測序結果的分析

測序都是從5'端進行的，正向和反向測序是指對DNA的兩條互補鏈分別測序，通常兩個方向測序結果經校讀后完全一致才能認為得到可靠結果。生工測序結果一般都提供兩個文檔，一個是TEXT的序列文檔，一個是用Chromas軟件打開的ABI文檔。

1.尋找引物

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 比對，去除引物序列，找到目的片段。

在DNAMan上進行比對，看引物能不能比對上（一個不變，一個反向互補），如果比不上，那可能就不是你要的序列，如果能比上，上游以引物第一個為分界線，去除前面的；下有一最后一個為分界線，去除后面的，剩下的就是目的序列。然后在NCBI上Blast.就OK了。

批注：PCR產物進行測序的結果可能不包含引物序列

2.將找到的對應目的片段轉成*.txt格式

3.下載BioEdit軟件

第一：打開Bioedit軟件，導入拼接好的樣品序列與標準亞型參考序列

File—New Alignment—Sequence—New Sequence—導入拼接好的樣品序列和標準參考序列（從TEXT文檔利用復制粘貼工具）—Apply and close —保存結果—關閉窗口

第二：點擊菜單欄上按鈕“Accessory Application”，選擇“Clustalw Multiple Alignment”

File—Open—Accessory Application—Clustalw Multiple Alignment

第三：比對結束后，刪除比對序列兩端的多余序列，使所有序列等長

選擇需要編輯的序列—Sequence—Edit Sequence—進行序列的編輯—保存修改后結果

第四：選擇“Sequence”菜單下的“Gaps”，點擊“Lock Gaps”

第五：將比對后的序列保存為Fasta 格式文檔

4.下載MAGE4.0軟件

1)    打開MEGA軟件，選擇“File”菜單欄中的“Convert To MEGA Format”，把序列文件的格式轉換為meg文檔保存；

2)    雙擊序列的meg文檔，選擇“Nucleotide Sequences”，點擊“OK”；

3)    程序運行中詢問是否為蛋白編碼序列，選擇“NO”；

4)    在MEGA操作界面選擇“Phylogeny”菜單欄下“Bootstrap Test of Phylogeny”中的“Neibour-Joining”；

5)    選擇“Test of Phylogeny”欄中的“Bootsrap”，“Replications”設定為1 000；在“Options Summary”欄中的“Model”項中，設定參數為“Kimura 2-Paramete”r，最后選擇“Compute”；

6)    將分析結果采用Los Alamos HIV序列庫提供的HIV-BLAST和Subtyping工具進行驗證