質譜和蛋白質組學：擊中目標

發布時間：2008-08-15 16:18 原文鏈接：質譜和蛋白質組學：擊中目標

Nature Methods - 5, 741 - 747 (2008) 作者：Nathan Blow 分析測試百科譯

近年來，質譜儀大幅提高了動態范圍和靈敏度，使研究者們在疾病生物標志物的發現和驗證方面，更從容地面對挑戰。

在2008年6月的美國質譜大會（ASMS）上，用于鑒定蛋白質生物標志物（指示了疾病或疾病狀態的蛋白質）的質譜儀，成為了在質譜制造廠商中反復出現的一個主題。

Waters公司（美國，馬薩諸塞州，Milford）推出了一款名為Xevo TQ MS的三重四極桿質譜儀，及其相應的軟件包，兩者都是為推動生物標志物從發現階段到目標蛋白的驗證階段而設計的。安捷倫科技（美國，加州，Foster市）推出了新的6400系列的三重四極桿液質聯用儀，并提高了靈敏度。“在串聯質譜上做驗證的優勢是提高了動態范圍和靈敏度。” James Langridge，Waters公司蛋白質組學業務發展部主任說。

“我認為我們正處在一個大有希望的時期，利用質譜來發現新的疾病生物標志物。”來自于圣地亞哥Sidney Kummel癌癥中心的 Jan Schnitzer說。但對于挑戰性的任務，如在血清和血漿等復雜樣品中發現生物標志物，儀器的動態范圍和靈敏度仍有局限。“血液的復雜性在于，其中存在比幾百種蛋白多得多的蛋白；當你深入分子多樣性的水平時，它過去是，現在在一定程度上仍然超出了我們的研究手段。” Schnitzer說。為規避這些限制，研究者們日益轉向發展新型方法和有針對性的方法，更有效地使用儀器。

最近，Thermo Scientific在他們的Orbitrap系統上增加了MALDI和電子轉移解離（ETD）

縮小范圍

“我認為現有儀器的動態范圍大概為10⁴。” 德國Martinsried馬普生物化學研究所的Matthias Mann在談到當今的各種質譜儀時說。然而，人血漿或血清的蛋白，估計大概跨越12個數量級的濃度范圍。

從儀器方面，似乎沒有簡便的方法來增加動態范圍。“我看不到任何機會去獲得10⁸或10¹⁰，這超出了當今技術的范圍。” Mann說。Waters公司的Langridge認為，質譜儀的動態范圍可能被已使用的離子化技術所限，如電噴霧離子化只具有5個數量級的動態范圍。

近期看來，儀器本身無法提升至覆蓋全部的濃度范圍，研究者們正在制訂方法來繞過這個問題。一開始，Mann指出，一些簡單的樣品制備方法，比如選擇性地捕獲某些蛋白類別來分析，或去除豐度最高的蛋白，都會幫助擴展現有儀器的動態范圍。“如果儀器能力有限，你唯一的選擇是分解所有的部分，然后進行分析。” Schnitzer說。

把復雜度降到最低

一種有效同時簡單的方法，就是在疾病生物標志物的研究中，處理那些較少挑戰性的樣本。“分析血漿蛋白質組非常困難，” Mann說，“但對于組織來說，我認為前景不錯，你可以利用現有的技術分析。” 組織樣本覆蓋的蛋白濃度范圍不像血漿那么寬，并有其它潛在的優勢。“人們相信組織更接近于疾病作用的位點，因此，組織中標志物的濃度水平潛在地會更高。” Waters公司的Langridge說。

儀器的制造商們，對于這種潛在的新途徑，已經開發了新的系統，直接進行基于質譜的組織分析。布魯克道爾頓公司（德國不萊梅），開發了Ultraflex III 型MALDI TOF/TOF系統，專門為組織成像設計，涵蓋了蛋白的質量范圍。今年早些時候，賽默飛世爾科技（美國馬薩諸塞州，Waltham），推出了MALDI離子源的LTQ Orbitrap質譜儀，也能被用于組織成像研究。

布魯克道爾頓公司MALDI應用開發和蛋白質組學部主管Detlev Suckau，和其他的科學家一同工作，使用基于質譜的組織成像技術鑒定了生物標志物。Suckau的方法是，首先用Ultraflex III TOF/TOF系統獲得一組組織圖像，然后對組織樣本進行分級的聚類，然后對每個類內的健康態進行病理學分配（assignments），最后用這些分配鑒定這些組的標記。

“令人吃驚的是，在如此短的時間內開發出智能的候選標志物預測方法，” 他強調，速度遠遠快于使用血清樣本獲得相等程度確定性的速度。不過他認為，由于基于質譜的、用于生物標志物發現的組織成像技術剛用于研究1～2年，所以評判它的技術潛力可能還為時過早。

直達目標

一些研究者，如Ruedi Aebersold，還沒有放棄對在血清樣本中尋找癌癥生物標志物的挑戰，但這需要更多的工作。在比較病人和健康人個體的整個血清樣本的試驗中，Aebersold發現，質譜不足以測到必要的ng/mL濃度，或者如果可能的話，需要大量的努力，并要求多臺質譜運轉——花費數百小時的機時——才能完成僅對兩個樣本的比較。“我得到的結論是，這條路不可行，” Aebersold說。

Waters公司新的Xevo TQ質譜是為輔助生物標志物驗證的過程而設計的

然而，他的研究組正在開發“目標蛋白質組”的方法來進行蛋白生物標志物發現。“我們會有目標地看看那些我們認為可能與疾病相關的、特定的蛋白質或蛋白質系列，” 他們最初使用獨立的方法，比如微陣列，文獻檢索和系統級分析，在染病的和正常的個體間比較分析，從而鑒定候選的蛋白質。他們用三重四極桿質譜的多反應監測（MRM）方法，來檢測和定量血清樣本中蛋白質的系列——尋找病體和正常樣品之間的差別。使用MRM，研究者們“指揮”儀器專門監測被選擇的離子質量，而忽略了其它離子，這樣的檢測分析選擇性強、靈敏度高。

Matthias Mann認為，使用無需同位素標記（Label-free）的方法進行質譜定量，有助于生物標志物的發現。

當然，使用這種目標的方法，你僅能發現你專門去尋找的那些生物標志物，但好處是減少了被質譜測定的蛋白的數量。“你消除了大量的噪音——人對人的噪音和其它的噪音——因為你沒有去測定大部分的蛋白，”Aebersold說。目標物的質譜方法，比非目標物的發現-比較方法，靈敏度獲得了量級的提高，特別是當面對如血清這種非常復雜的樣本時。

相似的，美國國立癌癥研究所實施的癌癥的臨床蛋白質組學技術（CPTAC）計劃，也資助于那些目標的、候選蛋白為基礎的方法。 “候選蛋白為基礎的方法更穩健、定量更準確，”Steven Carr說，他是美國馬薩諸塞州劍橋Broad研究所蛋白質組學平臺的主任，和CPTAC的研究員。在優先獨立觀測的基礎上，CPTAC和癌癥研究的團體一起工作，鑒定了和癌癥相關的大約1,000種候選蛋白生物標志物。這些候選物的子集，將被CPTAC參與者開發的高通量驗證方法來測試（見附錄：BOX1）。

新推出的三重四極桿質譜和軟件，可能幫助擴展目標物方法的用途。Waters公司的Xevo TQ質譜特點是：在實驗中做串聯質譜（MS/MS）采集，同時獲得定量的MRM數據，這在先前的串聯質譜上是不可能的。這種功能，使用戶可以根據MS/MS選擇感興趣的蛋白，然后在同一次試驗中對感興趣的離子進行MRM分析。系統利用了新的“VERIFYE'”軟件和Xevo TQ 質譜的優點，監測MS/MS分析中產生的所有的肽和蛋白，然后在目標物的方法中找到離子化和斷裂最強的碎片進行監控。

新的軟件和工具，比如賽默飛世爾科技新推出的Proteome Discoverer，使質譜數據的解析對用戶來說更容易。

數字游戲

“我認為質譜定量是一個非常令人興奮的領域，過去的幾年，在標記和非標記方面都取得了很多成果。” 布魯克道爾頓的Suckau說。在蛋白質組學研究團體中，質譜定量方法的崛起，是近年來廠商努力工作的結果，他們為研究者們開發了標記和非標記的方法及試劑盒。

在“標記方面”，賽默飛世爾科技推出了新的串聯質譜標簽（tandem mass tag）試劑盒，叫做TMT，用于標記實驗。TMT是位于英國Cobham的Proteome Science公司發明的。TMT包含帶有氨基活性基團的等量的串聯質量標簽，一個質量歸一化的連接子，一個可斷裂的化學鍵，和報告離子（reporter ion）系列。使用這些試劑，研究者們能夠在一個樣本中專門標記肽和蛋白，然后進行相對或絕對的定量。

相關鏈接：TMT試劑盒的介紹

在“非標記方面”，Mann直接指出，儀器的進步像催化劑一樣使定量方法日益流行。“我們有適于應用非標記方法的Orbitrap；和同樣具有良好分辨率的先進的TOF質譜；這是很好的一步，” Mann說。“通常我認為非標記方法非常有趣，尤其在生物標志物發現的環境背景方面。”

Lester Taylor，賽默飛世爾科技質譜和生命科學團隊的市場總監，指出了分辨率的重要性。“有大量的儀器提高了質量準確度（指對一個質量能測得多準），但只有質量準確度是不夠的。關鍵之一是要有足夠的分辨率（指分開兩個質量的能力），這樣你才能確信你正在監測的峰和其它干擾已經很好地分開。” Taylor說。

Aebersold的小組使用了標記和非標記兩種方法用于目標物蛋白質組研究。他的團隊傾向于使用ICAT或iTRAQ標記來進行潛在的生物標志物的驗證。“對于檢測血清中的目標多肽，我們使用了ICAT標記參比肽，以確定血清蛋白的絕對量，” 他說，“原因很簡單，你要準確地定量樣品中的多肽，并讀出絕對的濃度。” 但在最初的發現階段，他們使用非標記的方法來建立他們感興趣的蛋白列表，因為非標記方法花費較低，并具有更高的通量。

驗證和超越

“ 你必須分析大量的樣本，才能知道一個生物標志物是否具有臨床用途。” Langridge說，并談到蛋白生物標志物驗證的另一個問題：完全的樣本數目。因為人類種群的多樣性，對候選蛋白生物標志物進行統計學的有效驗證，可能要求研究幾百名病人的樣本。然而在開發階段，驗證必須的高分辨率儀器往往不適合高通量工作。

Carr認為這樣的通量問題會在近幾年被解決，通過開發穩健的高通量流水線（pipelines）。他認為在驗證階段大部分的瓶頸，不是來源于質譜本身，而是源于樣品制備。CPTAC的成員們，和更多的商業開發者們，正在努力開發新技術，來提高發現和驗證過程中所有部分的通量。

表1. 供應商指南：提供質譜儀及配件的公司（見附件）

附件：

BOX1 標準和實踐

2006年1月，美國國立癌癥研究所開始資助癌癥的臨床蛋白質組學技術（CPTAC）評估項目，一項為期5年、1.04億美元的計劃，用于拓展蛋白質組學技術在臨床癌癥診斷中的應用。

Steven Carr，位于Broad研究所的一個CPTAC研究組的首席研究員說，蛋白質組學至今仍未對臨床診斷做出重大貢獻。“技術沒有錯，而是我們對以下方面缺乏清晰的了解：技術基礎上能夠做什么、怎樣為這樣的平臺準備最好的臨床樣本，以及什么樣品最適于蛋白質組學研究，” Carr說。這是Carr領導的Broad研究所；紐約的斯隆-凱特林癌癥中心的CPTAC研究組；印第安納西拉法耶特的普渡大學；加州大學伯克利分校；田納西州納什維爾的范德比爾特大學醫學院，共同創建的一個標準化流水線，用于蛋白質生物標志物的發現和驗證。

這5個CPTAC小組合作，跨實驗室測試樣品，在兩個領域內建立標準化的程序：非歧視地發現蛋白質組，和用MRM技術進行候選物的驗證。通過保持所有他們有可能一致的條件——質譜系統，工作流程和標準操作程序——這5個研究組系統地研究了產生偏差/變化的來源。“關于非歧視地發現，研究組將使用多達100個蛋白質添加到復雜的生物背景（比如細胞裂解液）中，看看在不同豐度下，蛋白怎樣才能被可靠和重現的檢測。在樣本之間、各級的特定蛋白質的穩定的差別怎樣能夠被鑒定（模擬真正的生物標志物發現過程），假陽性率是多少。關于用MRM方法進行目標物驗證，我們正在使用穩定同位素標記的多肽，來定量添加到血漿中的蛋白質，并在5個不同的研究組的7臺儀器上，建立重現性，線性響應，和檢測限。” Carr解釋。

CPTAC現在正在進行下階段的生物標志物鑒定工作：大規模水平上的驗證流水線。來自華盛頓特區的血漿蛋白質研究所的Leigh Anderson說，流水線必須是穩健的，能夠被很好地驗證。“如果存在一個標志物，我們需要一條流水線，這樣我們才有把握去發現它。” 他說，因為他預測在臨床驗證階段，候選物大概有95～98％的篩出率。

Anderson 和Carr都認為，在驗證階段最大的挑戰來源于如何對待現有質譜儀器有限的靈敏度。他們指望著儀器制造商能提供靈敏度提高5～10倍的系統，來幫助解決問題。

英文原文：Mass spectrometry and proteomics: hitting the mark