探索RNA與蛋白的相互作用，你需要這兩種檢測

　　從DNA到蛋白質，這是一個相當復雜的過程。轉錄DNA的代碼，這只是萬里長征的第一步。隨后，大量蛋白質編輯RNA，帶領它從細胞核到細胞質，控制其穩定性，并指導其翻譯。

　　據印第安納大學的副教授Sarath Chandra Janga介紹，數百個RNA結合蛋白（RBP）參與了這個過程。Janga正在維護一個人類RNA結合蛋白的數據庫，他估計大約有3000個人類蛋白質與RNA結合，其中1400個已通過實驗確認。基于這一現象，許多科學家正在鑒定哪些RNA與哪些蛋白質相結合。

　　科學家有兩個主要選擇：核糖核蛋白免疫沉淀（RIP）和紫外交聯免疫沉淀（CLIP）。兩者都利用RNA結合蛋白的抗體來pull down結合的RNA，不過操作方法略有不同。杜克大學醫學中心的Jack D. Keene教授表示：“兩種方法各有用途，也各有缺點。”Keene教授是研究RNA調控的專家，曾在九十年代發明了最初的方法。

　　RIP vs. CLIP

　　在開展RIP檢測時，科學家從細胞提取物中拉下蛋白質-RNA復合物，然后利用測序來鑒定那些目標RNA。Keene喜歡這種技術，因為它能帶來與RBP天然結合的一切東西。同時，它也是定量的。數據告訴我們，某個RNA結合蛋白究竟與幾十個、幾百個還是幾千個RNA相結合。

　　不過，經典的RIP檢測不會告訴我們，具體哪幾個核苷酸在蛋白質的結合位點上；它只是鑒定出一組目標RNA。此外，據Janga介紹，它不僅僅拉下與目的蛋白結合的RNA。許多RNA結合蛋白是相互關聯的，因此RIP可能拉下所有關聯蛋白，以及它們當時結合的所有RNA。換句話說，在RIP檢測中，A的抗體也許會收集同一復合物中與B或C結合的RNA。

　　CLIP則希望解決這些問題，讓免疫沉淀僅限于感興趣的RBP以及與之互作的RNA。在免疫沉淀之前，科學家利用紫外光讓結合的伴侶緊密交聯。然后，他們利用酶來剪切所有未受抗體保護的RNA和蛋白質。與RIP一樣，科學家隨后通過測序來鑒定拉下的RNA。由于大部分未交聯的RNA被去除，CLIP可以鑒定出特定的結合序列。

　　當然，CLIP也存在一些問題。最關鍵的是，紫外光無法讓細胞中所有的RNA-蛋白互作形成交聯。這樣一來，科學家必須開展試錯實驗以確定適當的紫外劑量，既保證重要的生物互作形成交聯，又避免其他的RNA-蛋白組合來搗亂。

　　Keene表示：“交聯的效率可能只有5%，甚至更低。你也許錯過了相當一部分的結合位點。”基于這個原因，CLIP并不像RIP那樣是定量的，它無法區分RNA結合蛋白與這個或那個RNA目標的相對親和力。

　　產品選擇

　　開發RIP或CLIP試劑盒的公司并不多，而Keene將他的RIP和CLIPZL授權給MBL International Corporation。這家公司提供RIP檢測試劑盒、RiboTrap試劑盒以及RIP認證的抗體。

　　無論采用哪種技術，抗體的質量都是關鍵。MBL目前提供大約120種RNA結合蛋白的抗體，經過他們的精心驗證，大約有50種是對RIP有效的。獨立的ENCODE項目曾列出1027種適用于人和小鼠RNA結合蛋白的抗體，其中224種滿足結合目標蛋白的標準。

　　MBL還提供另一個方向的試劑盒：從感興趣的RNA開始，鑒定結合的蛋白質。在使用RiboTrap試劑盒時，研究人員首先利用5’-溴-UTP來合成其RNA誘餌，然后將合成的RNA與細胞裂解液共同孵育。之后，他們利用BrdU抗體來拉下RNA以及結合的蛋白，并通過質譜鑒定蛋白質。

　　MBL提供三種洗滌緩沖液供用戶選擇，以便發現RNA與RBP之間的強關聯或弱關聯。不過，據MBL的法規事務部主任Shinobu Kitamura介紹，強的相互作用不一定意味著它發揮關鍵的生物功能，弱的相互作用可能也很重要。

　　此外，默克生命科學也提供RIP的檢測試劑盒和抗體。據介紹，EZ-Magna RIP試劑盒提供陰性、陽性對照抗體以及對照引物，特別適用于該技術的初次使用者。它還提供經過RIP實驗驗證的抗體，可保證最可靠的實驗表現。

　　不過對于CLIP，只有少數實驗室能真正掌握它。Janga表示，數據也許很雜亂，許多可能的RNA目標突然出現。他認為，開展重復實驗會有所幫助，無論是同一樣品的，還是不同樣品的。“這些生物學重復和技術重復的確可以提高結果的效果和質量，”Janga說。Keene還建議用DO-RIP實驗的生物學重復，至少在三個不同的時間點收集細胞裂解液。

　　探索RNA-蛋白質相互作用的工具仍在不斷發展。供應商正與科學家合作，開發特異性更好的工具，這將幫助研究人員更好地了解RNP復合物的作用。請各位拭目以待吧。