一種新興的癌癥細胞療法—過繼性免疫治療

　　過繼性免疫治療（Adoptive Cell Transfer Therapy, ACT），是指從腫瘤患者體內分離免疫活性細胞，在體外進行擴增和功能鑒定，然后向患者回輸，從而達到直接殺傷腫瘤或激發機體的免疫應答殺傷腫瘤細胞的目的。過繼性免疫細胞治療主要包括TIL、LAK、CIK、DC、NK、TCR-T、CAR-T等幾大類。本篇文章作者重點介紹TIL、TCR-T以及CAR-T三種過繼性免疫療法，以及臨床試驗中的經驗教訓，為設計下一代免疫細胞療法提供有效指導原則（圖1）。

　　過繼性免疫治療

　　1、TIL-腫瘤浸潤淋巴細胞

　　TIL療法是從腫瘤附近組織中分離出TIL細胞，加入生長因子IL-2進行體外大量擴增，再回輸到患者體內，從而擴大免疫應答，治療原發或繼發腫瘤腫瘤的方法。目前TIL療法主要致力于提高T細胞的質量和表征，以及能簡化獲得腫瘤特異性T細胞的方法（圖2）。例如，研究提出PD-1和4-1BB能作為腫瘤標記物對外周血細胞庫進行篩選，獲得腫瘤特異性T細胞，分析輸注腫瘤特異性T細胞是否比傳統輸注TIL細胞更有效，這為T細胞個性化治療提供了一種非侵入性的策略。還有研究提出在接種疫苗或免疫檢查點抑制劑后，能潛在地分離出腫瘤特異性T細胞。

　　2、TCR-T療法

　　TCR-T療法是將患者體內的普通T細胞分離出來，利用基因工程技術引入新的基因，是轉基因T細胞表達能夠識別癌細胞的TCR-T，回輸到患者體內從而殺死腫瘤細胞的治療方法。

　　在早期方法中，T細胞修飾后具有表達靶向共同抗原的能力，但抗原在正常組織中也表達，治療過程會產生嚴重毒性。目前TCR-T細胞的治療已從腫瘤相關抗原轉移到腫瘤特異性抗原，在誘導強抗腫瘤作用時不會對正常細胞產生毒性。最新技術-腫瘤外顯子組測序和表位預測算法，能快速鑒定腫瘤細胞中因基因突變而產生的免疫原性新表位，也極大促進了TCR-T療法的發展。

　　TCR-T和TIL療法中T細胞的激活依賴于外部共刺激和通過MHC-I復合物呈遞靶向新表位，而MHC-I類復合物在癌細胞中通常被下調，所以可以通過CAR修飾T細胞，CAR-T無需MHC-I類復合物的呈遞，擴大了T細胞的激活信號。

　　3、CAR-T 嵌合抗原受體

　　嵌合抗原受體（CAR）是CAR-T的核心部件，通常由scFV細胞外結構域和提供TCR激活信號的西胞內信號傳導結構域組成。由于CAR-T細胞的抗原識別基于scFV結合腫瘤表面抗原，因此賦予T細胞非依賴式識別腫瘤抗原的能力。

　　細胞外糖蛋白CD19是CAR-T治療最常見的B細胞靶點，然而這幾年臨床試驗結果顯示使用CD19-CAR-T細胞有極高的復發率，研究人員針對此結果總結了一些重要的經驗：

　　（1）促進T細胞有效的增值反應是臨床療效的最佳預測標準；

　　（2）CD19-CAR-T細胞在不同B細胞腫瘤中的治療效果差異較大；

　　（3）CAR-T細胞功能障礙和CD19白血病細胞丟失是導致患者復發的主要原因；

　　（4）CAR-T治療可引起顯著的毒性，如細胞因子釋放綜合征和神經毒性等；

　　（5）在大多數患者中使用抗IL-6R抗體和類固醇可成功控制這些不良反應。

　　臨床數據顯示抗BCMA CAR-T細胞療法在血液癌癥中取得出色的臨床反應，目前研究人員希望應用CAR-T細胞療法治療實體瘤。在最近的一份研究報告中，針對IL-13Rα2的CAR-T細胞治療中，一名患者的轉移性膠質母細胞瘤完全消退，研究人員針對實體瘤的初步臨床實驗提出了一些有利于推動CAR-T療法的建議：

　　（1）盡管CAR-T細胞運輸到腫瘤細胞附近，但很少觀察到顯著的抗腫瘤反應；

　　（2）抗腫瘤效力與腫瘤中CAR-T細胞是否顯著擴增、持續存活有很大的關系；

　　（3）CAR-T細胞給藥后靶向抗原表達顯著降低或喪失，導致T細胞活性降低；

　　（4）在一些試驗中觀察到嚴重的靶向腫瘤外毒性，因此設計新型CAR-T細胞應增強腫瘤特異性抗原的靶向性以減輕毒性。

　　T細胞免疫治療當前障礙

　　1、T細胞擴增與持久性

　　過繼性轉移T細胞的顯著擴增和持久性是好的臨床效果的關鍵因素。一些TIL和TCR-T的臨床試驗結果顯示T細胞持續存在與腫瘤消退有很大的相關性。目前認為影響過繼性轉移T細胞持久性的因素有：患者的預處理、體外培養條件、T細胞衰竭、缺乏共刺激因子和宿主免疫應答。

　　2、T細胞功能障礙

　　T細胞效應功能的消失可能與內在（T細胞適應性）和外在（腫瘤微環境）有關。T細胞功能障礙包括T細胞無能、衰竭和衰老。功能性失調的T細胞，其增值和效應功能受損，還會表達各種免疫抑制性受體，例如PD-1，TIM-3，LAG-3，TIGIT和KLGR-1。在黑色素瘤患者中，從腫瘤中分離出來的大多數腫瘤反應性細胞都表達PD-1。

　　3、腫瘤異質性和抗原缺失

　　在臨床前和臨床研究中很多數據顯示，由于抗原丟失、抗原表達的異源性和抗原呈遞受損導致了腫瘤躲過免疫逃逸，這也被認為是臨床失敗的主要原因。

　　4、腫瘤污染

　　細胞治療產品中的腫瘤污染與自體干細胞移植的復發有關。CD19-CAR-T細胞由外周血淋巴細胞產生，對于患有急性白血病的患者，白細胞母細胞通常在收集時存在于外周血中。通常在CD19-CAR-T細胞擴增結束，通過流式細胞術檢測不到殘留的B細胞母細胞，因為CD19-CAR-T細胞在體外能有效地清除它們。 然而，最近研究發現一名患有CD19-CAR-T細胞（CTL019）的患者，在輸注后9個月后復發CD19陰性白血病，異常表達抗CD19 CAR蛋白，原因是在CD19-CAR-T細胞制造過程中，通過慢病毒轉導，CD19-CAR-T基因被無意地引入單個白血病B細胞，所以在篩選工程T細胞時應提高免疫選擇壓力，避免腫瘤污染。

　　5、毒性

　　使用CD19-CAR-T細胞療法，在一些B-ALL患者、B-CLL和B-NHL患者的中觀察到CRS綜合征，該綜合征的特征在于細胞因子（IL-6、TNF-α等）、炎癥外標志物（鐵蛋白，C-反應蛋白）表達增加，還伴隨發燒、低血壓、肌痛和其他全身癥狀；另外在針對Her2/neu抗原的CAR-T細胞治療中，雖然該抗原在肺中以低水平表達，但在一個早期試驗中導致快速和致命的毒性；工程T細胞的脫靶導致對健康組織的破壞也是常見毒性之一。

　　6、實體瘤

　　與血液系統惡性腫瘤相比，固體腫瘤遭遇更復雜的障礙。首先，T細胞必須滲入實體瘤中，在實體瘤中受到免疫抑制環境的影響，例如免疫抑制細胞（調節性T細胞，腫瘤相關巨噬細胞，髓樣抑制細胞）和一系列免疫抑制分子（PD-L1，IL-10，TGF-β）。另外許多具有免疫調節活性的酶在癌癥患者中上調，一氧化氮等氮化物產生增加。這些情況都限制了T細胞活化，導致腫瘤特異性T細胞在腫瘤中的持久性降低而失去治療效果。

　　7、個體化T細胞療法成本高，價格昂貴

　　改善T細胞免疫治療的策略

　　1、增強持久性

　　（1）通過優化CAR結構，可以有效影響T細胞的擴增和持久性。例如第二代CAR添加了共刺激結構域大大增強了T細胞的持久性和抗腫瘤作用，含有CD28和4-1BB共刺激結構域的CAR在臨床中使用最廣泛，研究表明，基于CD28的CAR具有較好的初始抗腫瘤作用，4-1BB信號傳導可以增強CAR-T細胞持久性，而第三代CAR結合了兩個共刺激結構域，將效力和長期持久性相結合。

　　（2）富集具有干細胞特性的T細胞，在較短的時間內完成擴增以減少T細胞的分化，改善T細胞在體內的持久性。

　　2、克服T細胞功能障礙

　　（1）保護過繼性轉移T細胞免受抑制信號的影響，例如利用基因編輯，敲除T細胞上的PD-1基因座或將CAR-T與免疫檢查點抑制劑聯合使用；

　　（2）優化CAR結構以調節表達，例如將CAR編碼序列插入到陽性TCR基因座中，可以減少強直信號傳導水平，延遲T細胞分化和衰竭；

　　3、克服抗原表達的缺失或抗原異質性

　　同時靶向多種抗原可以減少抗原陰性逃逸現象，例如使用雙特異性性或三特異性CAR-T細胞治療，結果顯示多重靶向在預防抗原逃逸現象中十分有效。

　　在CD19陰性白血病的臨床試驗中，共定位CD19和CD123可以起到防止抗原丟失和治療的效果。

　　4、利用細胞因子武裝T細胞-TRUCKs

　　由于腫瘤是一種混合型的細胞群，而CAR-T細胞無法對這一群體中那些表面不表達靶抗原的細胞進行殺傷，為了能徹底清除腫瘤細胞，設計了一種新型工程化T細胞-TRUCKs，這種被改造后的T細胞可以在CAR識別靶抗原后，通過激活下游轉錄因子NFAT來誘導促炎性細胞因子IL-2，從而招募環境中的其他免疫細胞參與對不表達靶抗原的腫瘤的清除。此外，被募集的腫瘤附近的免疫細胞還可以通過分泌某些細胞因子來調節腫瘤附近的微環境，解除免疫抑制性。

　　5、減少毒性

　　減少毒性最主要的策略，增強T細胞對腫瘤特異性抗原的靶向性，減少對正常組織中表達的抗原的靶向作用，新型CAR-T設計可以減輕細胞毒性和解決逃逸問題（圖3），其原理就是通過組合或者串聯兩種CAR-T，提高靶向的精確度，減少CAR-T的脫靶從而減少細胞毒性作用。

　　6、通用型CAR-T細胞

　　由于目前大部分的CAR-T細胞都是利用患者自身的T細胞來產生的，屬于個體化產物，產生定制T細胞是一個昂貴且耗時的過程。除此之外，每種CAR具有固定的抗原特異性，每種CAR-T制劑僅能靶向特定的表位，因此科學家們致力于開發一種通用型CAR-T細胞，生產一種現成的即用型治療劑。生產通用CAR-T細胞的設計原則是從同種異體健康受體產生腫瘤抗原特異性T細胞，通過基因編輯的方法破壞T細胞的TCR基因和HLAⅠ類基因，消除移植物抗宿主病（GVDH）。ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9是比較常用的基因編輯手段。

　　總結：過繼性免疫治療ACT領域正在快速的發展，科學界對如何提高T細胞殺傷效率、減少T細胞衰竭、優化T細胞的生成、開發通用T細胞、降低臨床毒性、避免腫瘤微環境免疫抑制等問題也正在進行深入的研究。目前ACT在一些癌癥領域中取得較好的結果，生產通用型CAR-T細胞有望擴大其在不同癌癥中的應用范圍。

　　參考文獻：

　　Sonia Guedan. Marco Ruella.et al. Emerging Cellular Therapies for Cancer. Annual Review of Immunology. 2018.11:7. https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-042718-041407.