一、 待測DNA的末端標記 化學降解法測序首先要制備單側末端標記的待測DNA片段。DNA片段的核素標記有三種方法： 1. 利用T4噬菌體多核苷酸激酶和γ-32P-ATP標記DNA的5-末端 對于去5′-磷酸化的DNA片段，T4噬菌體多核苷酸激酶可以通過正向反應將γ-32P-ATP的γ-磷酸基轉移至DNA的5-末端；對于5'-磷酸化的DNA片段，在過量ATP條件下，該酶可以通過交換反應將γ-32P-ATP的γ-磷酸基與DNA的5-末端磷酸基發生交換反應而標記。但對于雙鏈DNA片段，由于DNA的兩側均被標記，不能直接用于測序反應。需要經限制性內切酶切割，電泳分離二種不同大小的標記片段，或者直接用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離二條單鏈，但這種分離方法比較困難，較少使用。 2. 利用末端轉移酶和α-32P-ddNTP標記DNA的3-末端 在二價陽離子存在下，末端轉移酶催化dNTP加入DNA分子的3-羥基末端，如果作為底物的核苷酸經過修飾（如ddNTP），則可以在DNA的3-OH上僅加入一個核苷酸。對于雙鏈DNA片段，亦存在DNA的兩側均被標記問題，可通過上述同樣的方法分離。 3. 利用Klenow片段和α-32P-dNTP對限制性內切酶產生的3-凹進末端進行標記 這種方法能直接制備單側末端標記的DNA，但要求待測DNA能滿足下列條件之一：①DNA兩端的一側為3-凹進末端，而另一側為平端或3-凸出末端；②兩端雖均為3-凹進末端但末端單鏈結構不同，這時可選擇不同的γ-32P-NTP來實現末端標記。這是對雙鏈DNA進行不對稱標記的常用方法，如圖7-4-4所示。 CS載體系列（CS是chemical sequecing的縮寫）是專門為化學降解法測序進行末端標記而構建的一類克隆載體，如pSP64CS和pSP65CS。這類載體最重要的特點是，在待測DNA克隆片段的附近有兩個可被限制性酶Tth111識別的典型位點（GACN↓NNGTC，不對稱），能在克隆DNA片段兩側不同的3-凹進末端，從而方便地實現對待測DNA的單側標記。 值得特別注意的是，化學降解法對標記的待測DNA純度有較高的要求，因為鹽濃度會干擾肼對胸腺嘧啶的修飾，也會抑制A+G反應中的去嘌呤過程。因此，標記的DNA一般要經酚/氯仿抽提、70%乙醇洗滌除鹽，并用去離子水溶解而不用TE緩沖液。 二、 堿基特異的化學切割反應 在化學降解法中，專門用來對核苷酸作化學修飾并打開堿基環的化學試劑主要有肼（hydrazine）和二硫酸甲酯（dimethylsulphate）。 肼又叫聯氨（NH2-NH2），在堿性條件下，能作用于T/C的C4和/或C6原子位置，并同C4-C5- C6環化形成一種新的五元環。肼進一步作用釋放出吡唑啉酮環。在六氫吡啶的作用下，通過β消除反應，該堿基兩端的磷酸基團便會以磷酸分子形式從糖環上釋放出來，從而導致在這個核苷酸位置上發生DNA斷裂如果在此反應體系中加入1mol/L濃度的鹽，則肼同T的反應速率會下降，便可發生C特異的化學切割反應。因此，可以根據這一特點來區別C和C+T這2種化學切割反應。化學反應過程如圖7-21所示。 二硫酸甲酯[(CH3O)2SO2]，能使DNA堿基環中的氮原子發生甲基化反應。在DNA測序分析中所涉及的甲基化位點是G的N7原子和A的N3原子。在中性pH環境中，這2種堿基的甲基化作用，都足以導致其糖苷鍵發生水解作用，而留下失去堿基的糖-磷酸骨架。再通過堿催化的β-消除反應水解無堿基糖環兩端的磷酸二酯鍵，造成DNA在此位點發生斷裂。同時，已知DNA中G的N7原子甲基化速率比A的N3原子快4~10倍，故在中性條件下水解速率G位置也比A位置要快得多（差4~6倍），這是早期Maxam-Gilbert化學降解法測序辨別DNA中G和A的基本依據。現行的化學裂解反應，都采用六氫吡啶與DNA中的甲基化堿基反應，且這種反應對甲基化的G是特異的，因此這種DNA鏈的斷裂也僅發生在G殘基位點。化學反應過程如圖7-22所示。 化學反應設有5組獨立的反應：G反應（在G 殘基上的裂解）、A+G反應（在嘌呤殘基上的裂解）、C+T反應（在嘧啶殘基上的裂解）、C反應（在C殘基上的裂解）和A＞C反應（在A和C 殘基上的裂解），A＞C反應也可以不做。 三、測序圖譜的識讀 對于測序電泳圖譜的識讀，化學降解法測序要比末端終止法較為復雜，因為化學裂解反應并非是完全絕對堿基特異的。每組測序圖譜為5條或4條（A＞C反應可以不做）泳道。需要通過從C+T泳道出現的條帶中扣除C泳道的條帶而推斷T殘基的存在。類似地，A殘基的位置也要通過從A+G泳道中扣除G泳道的條帶推斷出來。同時，如果A＞C泳道中出現較強的條帶，則可確證A殘基的存在。 實際讀片時從膠片底部一個個地向頂部讀取。從下至上，一個一個地從G+A泳道和C+T泳道二個列中確定只相差一個堿基的條帶。如果在G+A泳道中出現一條帶，就看G泳道中是否有相同大小的帶，如果有即為G堿基，如果沒有則為A堿基；同樣，在C+T泳道中出現的條帶，就檢查C泳道中有無同樣大小的條帶，如果有即為C，無則為T。如果做了A＞C反應，在該列中出現較強的條帶時，可幫助A的確定。 四、化學降解法測序的優點 在化學降解法與鏈終止法問世之初，利用化學降解法進行測序不僅重復性更高，而且由于只需要簡單的化學試劑和一般的實驗條件，易為普通實驗室和研究人員所掌握。而鏈終止法需要單鏈模板、特異的寡核苷酸引物和高質量的大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段），這在二十世紀八十年代一般的實驗室很難做到。但隨著M13mp載體的發展、DNA合成技術的進步及Sanger法測序反應的不斷完善，至今DNA測序已大都采用Sanger法進行。然而，Maxam-Gilbert法可對合成的寡核苷酸進行測序，可以分析DNA甲基化修飾情況，還可以通過化學保護及修飾等干擾實驗來研究DNA的二級結構和DNA與蛋白質的相互作用，這些仍然是Maxam-Gilbert法所獨具的鮮明特點。 當然，如同雙脫氧終止法一樣，化學降解法測序的主要限制因素也是測序凝膠的分辨能力。化學測序法一般都用32P標記，所以與用32S標記作標記的末端終止法相比，它顯示的條帶較寬且有擴散現象，這限制了化學降解法在對較大DNA片段測序時的分辨能力。一般一塊電泳膠上最多能讀出200~250核苷酸序列。然而，如果按2個相反的取向分別從DNA片段的兩端進行測序，則可克服這一不足。 | 
