用于小鼠誘導多能干細胞的逆轉錄病毒的制備及感染

實驗概要

用于小鼠誘導多能干細胞的逆轉錄病毒的制備及感染

主要試劑

0.05%Trypsin、Polybrene、細胞基礎培養液、DPBS、凍存液、Lipo LTX、Opti-MEM、Plat-E培養液、0.1%明膠

主要設備

35 mm、60 mm、100 mm培養皿；1.5 mL、15 mL、50 mL離心管；0.45 μm濾器、超濾管

實驗材料

Plat-E細胞：Plat-E是非常重要的逆轉錄病毒包裝細胞系（Ecotropic），全稱是Platinum-E，來源于人胚腎(Human Embryonic Kidney, HEK)293細胞系。主要用于快速、短暫地產生高滴度逆轉錄病毒，同時也能用于穩定地產生逆轉錄病毒。由Plat-E包裝細胞系產生的病毒表達一種單嗜性的被膜，只能感染小鼠和大鼠細胞，因而安全性較高。
質粒：pMX-SOX2、pMX-OCT4、pMX-KLF4、pMX-C-MYC和pMX-GFP。這些質粒來源于addgene公司，質粒的詳細信息可從公司網站獲得。質粒擴增和提取的具體原理和步驟可見《分子克隆實驗指南》。
MEF細胞：MEF的原代培養、傳代、凍存及復蘇

實驗步驟

（1）Plat-E細胞的培養
①在1個100 mm培養皿上鋪3 mL0.1%的明膠。
！注意：Plat-E細胞貼壁效果較差，需要用明膠鋪皿。
② 0.5～1 h后，準備復蘇Plat-E細胞，事先在15 mL離心管中加入5 mL的復蘇液（即細胞基礎培養液）。
③從液氮罐中取出1管Plat-E細胞，放到37℃水浴中迅速融化,將細胞逐滴加到事先準備好的復蘇液中，室溫1000 r/min離心5 min。
④棄上清，將離心下來的細胞用Plat-E細胞培養液重懸，接種到吸棄明膠的100 mm培養皿上。
！注意：明膠需要鋪30 min以上，以保證Plat-E的貼壁效果，吸棄明膠之后需要用DPBS沖洗一遍培養皿。
⑤細胞接種后2天，當Plat-E細胞融合度達到90%之后，將細胞以1∶4的比例傳代：首先吸棄培養液，DPBS輕輕洗一遍細胞；加入0.05%Trypsin消化1 min，用細胞基礎培養液終止消化；將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，室溫1000 r/min離心5 min；吸棄上清，將離心下來的細胞用Plat-E培養液重懸，然后接種到新的鋪有明膠的培養皿中。
！注意：由于Plat-E細胞貼壁不牢，DPBS沖洗的時候不要太用力。
（2）逆轉錄病毒包裝
①當Plat-E細胞長滿培養皿之后，將細胞用0.05%Trypsin消化1 min，用細胞基礎培養液終止Trypsin消化，將細胞懸液轉移到15 mL離心管中，室溫1000 r/min離心5 min，棄上清，用Plat-E培養液重懸細胞，用細胞計數板計數，將細胞接種到5個鋪有0.1%明膠的100 mm培養皿上，每個培養皿上細胞接種的量是3×10⁶。
②24 h后，為Plat-E細胞換液：棄掉舊的培養液，在每個100 mm培養皿中加入5 mL的Opti-MEM。
③用LIPO LTX& Plus Reagent進行轉染：準備5個滅菌的1.5 mL離心管，在每個管中加入1 mL的Opti-MEM培養液；分別加入8 μg質粒（pMX-SOX2、pMX-OCT4、pMX-KLF4、pMX-C-MYC和pMX-GFP），用1 mL移液槍吹打混勻；在每個離心管中加入8μL的Plus，用1 mL移液槍吹打混勻，并在室溫中靜置5 min；在每個離心管中加入20 μL的Lipo LTX，輕輕混勻，室溫靜置30 min。將以上制備的1 mL的轉染試劑分別加到準備好的Plat-E細胞中，并前后振蕩混勻。然后將細胞放入培養箱中培養。
！注意：涉及到病毒操作的實驗應該在生物安全柜中操作，并且對于廢棄的細胞和廢液應該做消毒處理。
④12 h后，為轉染后的Plat-E細胞換液：棄去舊的培養液，盡可能吸凈，然后在每個培養皿中加入6 mL的不含SP的細胞基礎培養液。
⑤收集病毒：36 h后，收集各個培養皿的培養液，并向各個皿中補加6 mL不含SP的細胞基礎培養液，將收集的培養液分別用0.45μm濾器過濾，過濾后的培養液直接用于感染或者用超濾管濃縮后放置在-80℃冰箱備用。36 h后再次收集病毒，用同樣的方式處理。
！注意：由于病毒濃縮和凍存會造成病毒的損失，從而降低病毒的滴度，因此，為保證病毒的感染效率盡可能使用新鮮的病毒。
（3）逆轉錄病毒感染小鼠胚胎成纖維細胞
①MEF細胞傳代（具體方法參見P35），細胞密度為1×10⁵ cells/ 35 mm培養皿。
！注意：感染時細胞的密度至關重要，密度太低病毒感染會引起細胞死亡，密度太高病毒的感染效率下降。
②24 h后，將以上收集的4因子病毒等量混合，并輕輕混勻。
③將Polybrene溶液加入病毒溶液中，使其終濃度為4 μg/mL，并輕輕混勻。
④棄去MEF的培養液，然后將病毒液加入MEF細胞中，每個35 mm培養皿加2 mL的病毒液，記為Day 0。
⑤24 h后吸棄掉舊的細胞培養液，加入獲得的第2次收集的病毒液，記為Day 1。
⑥12 h后吸棄掉舊的細胞培養液，用細胞基礎培養液為細胞換液。
！注意：二次感染時間不宜過長,一般不超過12 h，時間過長對細胞的毒性較大。