蛙的細胞核移植

實驗概要

本實驗以蛙為實驗材料介紹了細胞核移植技術。

實驗原理

細胞核移植，就是將一個細胞核用顯微注射的方法放進另一個細胞里去。前者為供體，可以是胚胎的干細胞核，也可以是體細胞的核。受體大多是動物的卵子。因卵子的體積較大，操作容易，而且通過發育，可以把特征表現出來，因此細胞核移植技術，主要是用來研究胚胎發育過程中，細胞核和細胞質的功能，以及二者間的相互關系；探討有關遺傳，發育和細胞分化等方面的一些基本理論問題。該技術已有幾十年的歷史。1952年，Briggs   和King在兩棲類動物中首次獲得核移植成功，使得發育生物學上的幾個根本問題得到了解答。Gurdon用非洲爪蟾的上皮細胞等體細胞的核作移植，確立了已經分化的細胞核可以正常發育的事實。我國胚胎學家童第周先生等在魚類細胞核移植方面做了許多工作。他們在1976年前后首次獲得的鯉鯽移核魚，不僅有理論意義，而且也為魚類育種開辟了一條新的途徑。

主要試劑

1. 手術液：即 Holtfreter液，需煮沸消毒

2. 分離液：

NaCl 0.35g

KCl 0.005g

雙蒸水 100ml

待以上混合液煮沸消毒冷卻后加入

EDTA(乙二胺四乙酸)18.6mg

NaHCO₃ 0.02g

3. Ringer液

4. 70%酒精

5. 2%瓊脂

主要設備

1. 顯微操作器

2. 顯微注射器

3. 拉針器

4. 酒精噴燈

5. 虹膜剪刀

6. 尖頭鐘表鑷

7. 內徑12.5px，7.5px玻璃管

8. 1mm玻璃毛細管

9. 玻璃針

10. 培養皿

11. 彎頭吸管

12. 毛細吸管

13. 微吸管

14. 溫箱

15. 雙目解剖鏡

16. 顯微鏡

實驗材料

蛙受精卵，蛙囊胚晚期或原腸早期胚胎。

實驗步驟

1. 受體卵的準備

   1) 去膜

經人工催產使蛙卵成熟。擠出成熟的蛙卵，逐個去掉卵膠膜，接著把卵整齊地排列在高溫滅菌過的培養皿內，使其粘于皿底。并使卵子動物極朝上，以便進行激動和挑核。然后加入適量的手術液，每次可在一個培養皿內排列卵25-40個。

   2) 激動

蛙卵在未受精前仍處于第二次成熟分裂的中期。為了使卵子完成第二次成熟分裂，排出第二極體，在雙目解剖鏡下，用一枚消毒過的玻璃針在動物極靠近赤道的地區淺刺一下，目的是代替自然受精時精子入卵的過程。由于針刺動作比精子入卵的速度快得多，所以針刺手術要輕緩。激動后的卵子，10-15分鐘后產生第二極體。在解剖鏡下可見動物極附近有一折光的圓形小球，此即第二極體。

   3) 挑核

當第二極體出現時，用一枚消毒過的玻璃針在極體處斜插入卵子表層，然后迅速提起針尖，由于卵黃膜的破裂，極體下的卵核隨著一小部分細胞質流出卵外，形成一個卵外球，一般極體排出15分鐘以后會逐漸消失。這樣挑核應在極體出先后10分鐘內完成，否則核將沉入卵子中心，去核手術不易成功。

   4) 再去膜

挑核后經過10分鐘左右，待傷口基本愈合時，用兩把磨的很尖的鐘表鑷子，漸次剝去卵外膠膜，直至余下一層受精膜為止。操作步驟如下：在雙目解剖鏡下，先將一把尖頭鑷子的一邊尖端從卵子附著皿底的膠膜處小心而快速地插入到最內層膠膜，然后夾緊膠膜，把卵固定住，再用另一把鑷子從卵子另一側夾緊膠膜，向上向后把膠膜掀去，若用兩把鑷子左右對拉，則易損傷卵子，且使卵質變位，影響胚胎發育。

剝膜后的卵子移到盛有手術液的培養皿中置于玻璃板上，供注核用。

2. 供體細胞的分離

取囊胚或早期原腸胚的外胚層作為供體細胞。先在濾紙上除去膠膜，然后移入皿底涂有一層瓊脂的并盛有分離液的培養皿中，用兩把鑷子剝去胚胎外余下的各層膠膜，切下外胚層，吸去不用的胚胎部分。一個很小的組織塊放在分離液內數分鐘，并輕輕搖動，細胞便可自行分散。如不分散，可用毛細吸管輕輕吹打。

分散后的胚胎細胞用毛細吸管移到盛有手術液的培養皿中，置于涂有瓊脂的小載玻片上，作為移植時的供體細胞。

3. 核移植

   1) 顯微注射器的準備

每次手術前應向顯微注射器的整個管道系統灌入手術液或雙蒸水，檢查管道的各銜接處有否漏氣。管內只要有一極小的氣泡，注射器的調節就失靈。同時應注意選擇彈簧上彈性較靈敏的部位以便操作準確。
   2) 微型吸管的制備

吸管最好用軟質玻璃管。制作前，先將玻管用洗液洗凈，再用蒸餾水徹底將酸洗去。這樣可使拉出的微吸管內部潔凈，不致影響細胞核的吸入和射出。將玻管拉成口徑1mm的細管，然后在微火焰上，再拉成微吸管，管徑在10-20微米之間。

   3) 吸細胞核

吸核的方法不是將微吸管頭刺入供體細胞內吸取細胞核，而是利用顯微操縱臺通過輕輕地來回轉動千分尺外徑，將一個細胞慢慢地吸入微吸管。必須注意微吸管的內徑要比細胞小，這樣能使被吸入的細胞由于吸力的作用而破裂，結果可以依靠目測，將細胞核和包在它周圍的一部分細胞質一起吸入管內，避免細胞核直接與液體接觸，以免受損。還應調節使供體細胞盡量靠近管口，避免注核時帶入較多的手術液。

   4) 注核

將吸有供體細胞核的微吸管在離動物極45度左右的地方刺入動物半球的中心，再稍微向上提一下管口，然后輕輕地推動微量注射器，把管內的細胞核連同周圍的細胞質慢慢地注入卵內。如果注射速度太快，注入卵內的壓力過大，則會使卵子破裂，導致實驗失敗。

一般從首次去膠膜到注完15個左右的核，需2-2.5小時，時間過長，將會影響移核卵的發育。

   5) 培養觀察

移核后的卵子轉入1/10 Holtfreter 液中，置25℃恒溫箱中培養。及時觀察卵子的發育并做好記錄。

   6) 用同批卵按常規人工授精的方法獲得受精卵，置培養皿中在同等溫度條件下培養，以便與移核卵作對比觀察。