蛋白質定量／蛋白質含量的測定(LOWRY法)

實驗概要

運用LOWRY法測定蛋白質的含量。

實驗原理

Lowry法是雙縮脲法和福林酚法的結合與發展，其原理是：蛋白質溶液用堿性銅溶液處理，形成銅-蛋白質的絡合鹽，再加入酚試劑后，除使肽鏈中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等顯色外，還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此，Lowry法的顯色效果比單獨使用酚試劑強烈3～15倍，為雙縮脲法100倍。由于肽鍵顯色效果增強，從而減小了因蛋白質種類引起的偏差。
 

Lowry法的試劑由兩部分組成，試劑甲相當于雙縮脲試劑（堿性銅溶液），可與蛋白質中的肽鍵起顯色反應；試劑乙為磷鎢酸和磷鉬酸混合液，在堿性條件下極不穩定，易被酚類化合物還原生成鉬藍和鎢藍混合物而呈藍色反應，因此蛋白質的酪氨酸和胱氨酸等可顯色，顏色深淺與蛋白質含量成正比。

主要試劑

Na₂WO₄?2H₂O；Na₂MoO₄?2H₂O；85% H₃PO₄；濃HCl；Li₂SO₄?H₂O；溴水；酚酞指示劑；Na₂CO₃；NaOH；CuSO₄?5H₂O；酒石酸鉀鈉；
 

牛血清白蛋白：用水配成250mg/ml。

主要設備

試管若干；刻度吸管0.5ml，1ml，10ml；定量加樣器；圓底燒瓶；冷凝管一套（帶橡膠管）；微量滴定管；小燒杯；微量進樣器50μl；分光光度計。

實驗材料

可溶性蛋白質

實驗步驟

1. 酚試劑的制備

  （1）取Na₂WO₄?2H₂O 100g，Na₂MoO₄?2H₂O 25g 及蒸餾水700ml于1500ml的圓底燒瓶中，之后加入85% H₃PO₄ 50ml，濃HCl 100ml。安上回流冷卻裝置（使用磨口接頭。用軟木塞或橡皮塞時，必須用錫泊包起來），使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入Li₂SO₄?H₂O 150g，水50ml，濃HCl 100ml安上回流冷卻裝置，開口加熱煮沸15min，以逐出過量的溴。冷卻后稀釋至100ml，并過濾入棕色瓶中，密閉于冰箱中保存。

    使用時用標準NaOH溶液滴定，以酚酞為指示劑。滴定終點由藍變灰。滴定后算出酸濃度，用時適量稀釋，使最后濃度為1mol/L H＋，此為Folin-酚試劑乙液。
 

  （2）首先配制①4% Na₂CO₃溶液；②0.2mol/L NaOH溶液；③1% CuSO₄溶液；④2%酒后石酸鉀鈉溶液；使用前①與②等體積混合配成Na₂CO₃-NaOH溶液；將③與④等體積混合配成硫酸銅一酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩個溶液按50︰1混合；配成Folin-酚試劑甲液。此試劑只能用一天。
 

2. 標準曲線的繪制

  （1）取7只試管編號,分別加0ml，0.1ml，0.2ml，0.4ml，O.6ml，0.8ml，1.0ml標準蛋白質溶液，用水補到1ml，便成為每管含蛋白為0mg，25mg，50mg，100mg，150mg，200mg，250mg標準系列（必要時可做重復）。

  （2）加5ml試劑甲，混勻，于30℃放置10min。

  （3）噴射加入0.5ml試劑乙，立即振蕩混勻，在30℃下保溫30min。

  （4）準確到30分后，以不加標準蛋白的管為空白，在500nm波長下比色測定吸光度值。

  （5）以蛋白濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。
 

3. 樣品測定

  （1）取50μl樣液加入試管中，（樣液提取一般按0.1g鮮樣/ml比例，提取方法見各酶活測定）加蒸餾水補至1ml，然后重復步驟2的（2），（3），（4），以空白為參比，測吸光度值。

  （2）根據吸光度值，查標準曲線求得蛋白質含量。
 
4. 結果計算

蛋白質含量（mg/g鮮重）＝ (C*V/a)/W 
 

式中  C－查標準曲線得樣品測定管中蛋白質含量（mg）；

V－提取液總量（ml）；

a－測定時取樣液量（ml）；

W－取樣量（g）。

注意事項

1. Folin試劑乙只在酸性條件穩定，故當其加到堿性的銅-蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前，還原反應即能發生。
2. 為了保證反應進行完全，反應在25～30℃水浴中進行，反應30min后準時比色。
3. 還原物質干擾本實驗。

 
考馬斯亮藍法和LOWRY法兩種方法均是靈敏度為微克級的高靈敏度定量測定蛋白質方法，前者穩定，后者簡便；二者均優于現有的其它方法。
二者的缺點是：
1. Lowry法受植物體內存在的酚類物質干擾；
2. 考馬斯亮藍法在蛋白質含量很高時線性關系稍偏低，且不同蛋白質與色素結合狀況有差異。