線粒體損傷與檢測方法研究進展

作者：左錢飛,張海獻,魯鵬飛

　　摘 要:線粒體是細胞活動的“能源工廠”,在各種致病因素作用下線粒體極易出現各種結構和功能損傷,這在疾病的發展中起著十分重要的影響,文章就線粒體結構和功能損傷及其檢測方法作一綜述。 
　　關鍵詞:線粒體損傷;mtDNA;凋亡 
　　Abstract:Mitochondria are cell activities of the "energy factories", in a variety of pathogenic factors appear vulnerable to a variety of mitochondrial structure and function of injury, which in the development of the disease plays an important role. This article on the structure and function of mitochondrial damage and its detection methods are reviewed. 
　　Key words: mitochondrial injury mtDNAApoptosis 
　　 
　　線粒體在生物的生長、發育、代謝、衰老、疾病、死亡以及生物進化等方面都有非常重要的意義,而在各種致病因素作用下線粒體極易出現各種結構和功能損傷。在細胞凋亡過程中,內源性核酸內切酶、Caspase蛋白酶家族、信號轉導系統、凋亡相關基因、氧自由基、Ca2+ 、NO、能量代謝、線粒體都參與了凋亡的發生線粒體與細胞凋亡間存在著密切關系,這在疾病的發展中起著十分重要的影響,因此對線粒體損傷的檢測也有非常關鍵的意義。 
　　1mtDNA損傷及其修復 
　　1.1ROS 對mtDNA 的氧化損傷 
　　人類mtDNA 編碼維持細胞電子傳遞鏈和ATP生成等生理活動所必需的13 種多肽、22 種轉運RNA(tRNA) 和2種核糖體RNA( rRNA)。mtDNA遭受氧化應激,將導致解偶聯蛋白2 (UCP - 2) 基因、電位依賴性陰離子通道1(VDAC - 1) 、PRDX3 基因和Raf 基因等基因的受損,使其蛋白表達發生改變。因而,一旦mtDNA 受到不可修復的氧化應激,將導致線粒體呼吸鏈的中斷、膜電位的崩潰和ATP合成障礙,導致細胞凋亡。即ROS 可導致mtDNA 損傷,mtDNA 損傷導致線粒體多肽表達改變,繼發電子傳遞鏈功能下降,ATP 生成減少,線粒體膜電位下降,ROS 生成增多,細胞色素C 和凋亡誘導因子(AIF) 的釋放,最終導致細胞死亡。Gonzalo R 等認為,mtDNA的突變影響了線粒體復合酶Ⅰ的活性,從而經電子漏生成的O2-會顯著增多,使線粒體ROS 過量產生,而抗氧化酶的活性沒有改變,從而導致線粒體內脂質和mtDNA 的氧化加強。 
　　1.2mtDNA損傷修復 
　　mtDNA 損傷包括DNA 單鏈斷裂、雙鏈斷裂、堿基修飾、DNA 鏈間交聯等。修復是指DNA 化學組成和核苷酸序列重新恢復的一種過程。mtDNA 中堿基切除修復最為普遍,并輔以其他方式修復多種損傷。如通過尿嘧啶DNA 糖苷酶、AP 核酸內切酶、DNA 聚合酶和連接酶等完成尿嘧啶和無堿基位點修復;利用甲酰嘧啶DNA 糖苷酶、8 - oxodGDNA 糖苷酶(mtODE) 、腺嘌呤DNA 糖苷酶(ADG) 和h Mutγ(變位酶γ) 等對mtDNA氧化損傷進行修復;還有轉換修復、錯配和烷化損傷的修復以及重組修復等。如鏈內交聯被認為是通過重組修復機制修復,酵母線粒體光合酶利用光使DNA 中紫外光誘導產生的環苯嘧啶二聚體單體化,大鼠肝臟線粒體O6 -甲基- 鳥嘌呤DNA 甲基轉移酶切除mtDNA 中O6 - 甲基- 2′- 脫氧鳥嘌呤,一些試劑如鏈尿菌素、亞硝基脲用于基因特異分析中證實了mtDNA 烷化損傷的特異性切除,但線粒體缺乏核苷酸切除修復機制。有人已利用一些純化酶,如UDG、AP 內切酶、DNA 聚合酶和連接酶等構建了mtBER 機制,并用于檢測不同DNA 損傷和揭示線粒體修復的生化機制。弄清什么類型DNA 修復蛋白存在于線粒體,如何調節、如何抵達線粒體等已不十分遙遠,這無疑對線粒體疾病的基因治療有重要意義。 
　　2線粒體損傷與細胞凋亡 
　　線粒體在細胞凋亡中的作用包括:釋放Caspases激活因子如Cyto-c;喪失電子轉移功能并減少能量的產生;線粒體跨膜電位的消失以及與BCL-2蛋白家族促凋亡和抑制凋亡功能相關等方面。實驗證明,γ輻射、Ceramide(凋亡信號轉導中的重要分子,介于促凋亡信號和凋亡過程之間)、Fas與配體結合等均可導致線粒體在電子轉移方面功能的紊亂,從而影響呼吸鏈,ATP產量下降。這種能量代謝上的障礙主要發生在細胞凋亡的晚期,線粒體在細胞凋亡過程中最重要的一點在于它可釋放能夠激活Caspases的蛋白。從線粒體釋放的Cyto-c與Apaf-1、Procaspase 9結合在一起形成“凋亡體”,其結果是Caspase 9的激活。除Cyto- c之外,線粒體還可釋放其他介導細胞凋亡的分子:Procaspase 3和AI(Apoptosis-inducing factor)。AIF在體外可作用于Procaspase 3,并且其本身可能就是一個Caspase。線粒體發生上述改變的機制在于線粒體膜上一種叫PT通道(Permeability transiton pore)的形成。促凋亡信號會使Caspases激活、胞漿Ca2+水平升高、產生Ceramide,諸如此類的改變會直接或間接地引發PT通道。PT通道是由線粒體一些內膜外膜蛋白組成的,定位于內外膜接觸點,并可以無選擇性地允許≤1.5kD分子通過。這個通道的開放會由于線粒體基質內的高滲透壓,使線粒體內外H+梯度消失,呼吸鏈脫偶連,能量產生中斷;還會由于水和溶質的進入使基質腫脹并導致外膜破裂,釋放出包括Cyto-c在內的各種活性蛋白。線粒體在細胞凋亡中的重要性還在于它與Bcl-2基因家族之間的關系。實際上,很多Bcl-2家族的蛋白如BCL-2、BAX、BCL-XL等都定位于線粒體膜上。而且實驗證實,BCL-2家族蛋白可以影響PT通道開放及其Cyto-c、AIF的釋放,還可以改變線粒體外膜的通透性。如BAX一方面可以直接促使線粒體膜內的大小約為12kD的Cyto-c在外膜未被破壞的情況下通過某種通道釋放至胞漿;另一方面,又可以激發PT通道的開放。而BCL-2蛋白則起抑制作用。線粒體及Cyto-c在細胞凋亡中的中心地位雖然在不同信號誘導的細胞凋亡中不一定具有普遍意義,但線粒體作為細胞內死亡信號的感受者和放大者在細胞凋亡中的重要性是勿庸置疑的。

　　3線粒體損傷的病理生理變化 
　　線粒體受損后的病理變化主要是形態的改變、膜電位的改變、對Ca2+ 通透性的改變、膜磷酯減少以及氧化磷酸化解偶聯等。脂質過氧化作用可使膜酶受到損傷、膜的通透性增加、膜受體失活、膜的流動性下降, 正常難以透過的物質如Ca2+ 的通透性增加, 而膜對Ca2+通透性的增加可進一步加重氧自由基對線粒體膜的損傷[5]。線粒體膜系統的損傷可導致線粒體氧化磷酸化功能的喪失。線粒體內膜通透性小,內膜上存在一些載體蛋白可以運輸一些物質, 質子泵存在于內膜, 可將基質內質子泵入外室, 這樣就形成了線粒體內膜跨膜電位。跨膜電位內室為負外室為正, 當線粒體膜因脂質過氧化作用受損后, 線粒體內膜跨膜電位下降, 線粒體在調節細胞內Ca2+濃度上起著至關重要的作用, 它可以通過多種機制吸收和釋放Ca2+ , 在細胞內Ca2+超載時線粒體攝取胞漿中的Ca2+。在脂質過氧化時由于線粒體膜受損可導致Ca2+的通透性增加從而導致細胞的死亡 , Ca2+ 通透性的增加還可導致氧化磷酸化的解偶聯, 鈣誘導的解偶聯可被脂質過氧化抑制劑所控制。 
　　4線粒體損傷的檢測方法 
　　4.1MPTP,膜磷脂,膜電位檢測 
　　對受損線粒體的檢測包括對線粒體滲透轉換孔(mitochon2dria permeability transition pore , MPTP) 的檢測、膜磷脂的檢測、及膜電位的檢測等等。MPTP 是線粒體滲透轉換功能的結構基礎, 是環孢菌素A 敏感性通道, 是線粒體內外膜結合處的一種蛋白性通道。MTPT 對細胞內多種離子濃度變化非常敏感, 特別是對在細胞內信號傳導系統有重要作用的Ca2+ 的濃度變化敏感, MPTP 的大量開啟能引起膜電位的崩解并導致細胞的凋亡。MPTP 的檢測方法有活性物質標記法、膜片鉗法、分光光度法等, 其中分光光度法較為簡單易用。脂質過氧化作用可以導致膜磷脂的減少, 對線粒體膜磷脂的檢測對判定線粒體功能具有重要意義, 對差速離心法分離出的線粒體膜磷脂可采用高效液相色譜進行檢測,也可用毛細血管電泳聯合熒光顯微鏡技術檢測。受損線粒體膜電位的變化可采用膜片鉗技術進行檢測, 也可采用熒光探針的方法測定。

4.2mtDNA損傷檢測 
　　(1)DNA 測序是檢測mtDNA 序列多態性最常用的方法之一,該方法具有準確度高、結果穩定等特點。直接測序被認為是檢測單核苷酸多態性和突變的金標準,但是其敏感性有限,異質性> 20%時,直接測序才可以檢出。 
　　(2)序列特異性寡核苷酸探針分析通過對基因特異性的寡核苷酸探針與基因的雜交的情況可以判定基因是否突變。序列特異性寡核苷酸探針分析技術有操作簡單、靈敏性高、特異性好等優點,但目前所用基因座較少,系統的個人識別能力有限是其局限性。 
　　(3)限制性酶切片段長度多態性分析是先將靶基因相關片段用PCR擴增,然后限制性內切酶能夠特異性地識別特定的堿基序列對擴增產物片段進行酶切,通過電泳可將酶切片段分離檢測。 
　　(4)單鏈構象多態性DNA 分子在凝膠電泳中的泳動速率除取決于其相對分子質量的大小外,還受到空間構型的影響。當單鏈DNA分子中存在由于各種突變導致其核苷酸序列的微小變化時,這些變化會影響DNA分子的構象,從而使其在凝膠電泳中的泳動速率發生改變。因此,從泳動率的改變可以檢測到基因突變。該技術具有簡單、快速、敏感性高、需要樣本量少、適合大量樣本篩選等優點。 
　　(5)變性梯度凝膠電泳是一項根據DNA 解鏈特性分離鑒定DNA 片段的技術。變性梯度凝膠電泳需要制備新鮮的梯度膠,檢出率也較低,且只能確定突變的存在,不能進行突變位置和性質的定量分析。但變性梯度凝膠電泳無需知道待測片段的DNA序列,無需制備測試引物。 
　　(6)變性高效液相色譜技術是一種新的高通量篩選DNA序列變異的技術,其利用離子對反向高效液相色譜原理,通過一個DNA分離柱進行核苷酸片段的分離和分析。該方法具有自動化、快速、檢出率高、檢測DNA片段大小范圍廣等優點。然而,DHPLC也存在一些缺點: ①不能檢測純合突變; ②只能提示突變的存在,無法確定具體的錯配類型及位置; ③許多片段有多個主要解鏈溫度,需要篩查的溫度點較多,增加了工作量。 
　　(7)實時熒光定量PCR技術是指在PCR 反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號累積實時監測整個PCR 進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。此法可快速定量檢測異質性mtDNA,比多態性分析檢測低頻率突變體更為精確。 
　　(8)其他基質輔助激光解離吸附飛行時間質譜、基因芯片等檢測堿基變異的方法也都可以用于mtDNA異質性的檢測。 
　　5結束語 
　　綜上所述, 線粒體是細胞能量的主要來源, 對維護細胞正常生理功能起著重要作用。線粒體與氧自由基的產生、細胞死亡進程的調控有關。許多毒物可以通過脂質過氧化作用對線粒體膜、膜蛋白及線粒體DNA 造成損傷, 線粒體損傷和功能障礙與許多疾病的發生有密切關系。這種損傷往往發生在對能量要求較高的處于有絲分裂的組織如心肌、大腦等。因此對線粒體結構功能損傷的檢測, 特別是從亞細胞和分子水平研究線粒體損傷的結構功能變化, 對闡明與線粒體受損有關的細胞功能障礙及疾病的發病機制有著重要的意義。