Westernbloting綜述

摘要：本文主要是針對Western bloting的原理及操作進行了簡單的闡述，Western印跡法是利用抗原抗體的免疫反應，先將蛋白通過SDS-PAGE電泳分離開來，然后再利用電場力的作用將膠上的蛋白轉移到固相載體（NC膜）上，然后再加抗體形成抗原抗體復合物，利用發光或顯色原理將結果顯示到膜或底片上。同時對Western bloting在實際操作中應注意的細節問題進行了歸納以及與其它免疫技術就抗體檢測方面進行了比較。

關鍵詞：Western bloting；免疫；轉膜；顯色；抗體


印跡法(bloting)是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC）上，并利用DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質印跡分析稱為Western印跡法（Western bloting），對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

一、        Western bloting的原理
    Western bloting首先是要將電泳后分離的蛋白從凝膠中轉移到NC膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片NC膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到NC膜上，NC膜可以與蛋白質通過疏水作用產生不可逆的結合。但是這種方法轉移效率低，通常只能轉移凝膠中的一小部分蛋白質（10%-20%）。而電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和NC膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質在電場力的作用下離開凝膠結合到NC膜上。常用的電泳轉移方法有濕轉和半干轉。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機械裝置不同。濕轉是一種傳統方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積緩沖液且只能用一種緩沖液。半干轉移，用浸透緩沖液的多層濾紙代替緩沖液槽。與濕轉相比，這種方法要快（15-45 分鐘）。
轉移后的NC膜就稱為一個印跡（blot）,用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液（如10%的BSA或脫脂奶粉溶液）處理以封閉NC膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗體（一抗）處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗特異結合形成抗原抗體復合物，而其它的蛋白質不能與一抗結合，這樣清洗除去未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗就是抗鼠IgG的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合形成抗體復合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。目前有結合各種標記物的抗體特定IgG的抗體（二抗）可以直接購買，最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當的底物溶液處理，當酶催化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區帶，指示所要研究的蛋白質位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽（BCIP）轉化為藍色的產物；而辣根過氧化物酶可以將H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾并發光，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測出辣根過氧化物酶的存在，即目標蛋白質的存在了。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，比如：熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗（可通過紫外燈產生熒光）；生物素結合的二抗等等。
除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。
在Western bloting實驗中，有另一種方法，就是直接標記一抗，再用底物顯色。這種方法叫直接法，與用二抗的間接法相比有諸多不足，標記二抗可用于很多種不同特異性的一抗，避免了標記很多一抗的需要，同時因為一抗結合不止一個二抗分子，所以二抗可以增強信號。所以一般情況下都釆用間接法進行檢測。

二、        Western bloting的操作(間接法)
1、        蛋白質樣品（抗原）的制備：
①  細胞的處理方法：向收集到的細胞中加入RIPA裂解緩沖液（三中蛋白酶抑制在使用前加入，終濃度為2ug/ml）在冰上裂解30—60min，然后再插入冰盒進行超聲，超聲強度以不產生泡沫為準，超聲每次2-3秒，重復3-4次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。（超聲強度不能過大，防止蛋白碳化）
組織的處理方法：按實驗要求將組織從動物體內取出（樣品不宜反復凍融），取少量（1-2g左右）放入玻璃勻槳器中研磨成勻漿，然后轉入EP管中進行超聲，超聲強度以不產生泡沫為準，超聲每次5-7秒，重復5-6次，再離心12000rpm3-5min，吸取上清備用。
②上述兩種方法得來的樣品處理液還要加入1/4體積左右的上樣Buffer，然后放在沸水浴中加熱3-4min使蛋白變性，方可作為樣品點樣。（注意：在加熱組織裂解液時，肝臟和腎臟組織要特別注意其本身濃度，最好是在制作裂解液時就適當稀釋，否則加熱后會凝結成固態。還有些組織處理后很粘稠，有帶絲狀物，這是未裂解的核酸，可以適當離心后再用。）
2、        SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS－PAGE）
①根據要求配制好SDS-聚丙烯酸胺凝膠（一般釆用10%的SDS－PAGE）
②將已配制好的凝膠裝入電泳儀中（注意不要漏液）。
③設計加樣順序，作好實驗記錄，按預定順序加樣。一般裂解液我們按10-20ul/道點樣，重組蛋白按1-2ug/道點樣。
④把電泳裝置與電源連接好，將電壓調至100V電泳10-20min，待溴酚藍遷移出積層膠位置再換用200V，30-40min后關閉電源。
⑤從電泳裝置上卸下凝膠玻璃板，用水沖洗干凈，準備轉膜。
4．轉膜（濕轉）
① 將凝膠玻璃板置于盛有電泳轉移緩沖液的容器中，浸泡幾分鐘。
② 帶上手套，準備好濾紙和NC膜（83mm×75mm），盡量避免污染濾紙和膜，將裁減好的濾紙和膜浸泡與電泳轉移緩沖液中，驅除留于膜上的氣泡。
③ 打開轉移盒并放置淺盤中，用轉移緩沖液將海綿墊完全浸透后將其放在轉移盒壁上，海綿上再放置一張浸濕的濾紙。
④ 按“海綿—濾紙—凝膠—NC膜—濾紙—海綿”的順序裝置好（注意不能有氣泡且裝置電極槽不能放反）
⑤將冰盒裝入緩沖液槽，注滿4℃預冷的轉移緩沖液。
⑥將整個裝置放在冰浴中用磁力攪拌器攪拌，連接好轉移電極恒流300mA轉移90min。電轉完畢后，將NC膜作好記號置于5%的脫脂奶粉（PBS配制）中封閉，37℃2小時或4℃過夜。
5．加一抗與抗原結合
①將加樣槽洗滌干凈，將膜用一次性手套覆蓋好，按標記和實驗設計切下膜條并作好記號，按順序置于加樣槽中加入相應的一抗約1ml，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。
②室溫下于搖床孵育2h或4℃過夜。
③棄去一抗，膜條仍置于加樣槽，每個槽中的膜用PBST在搖床洗滌洗滌5min左右 ，換液，反復4-5次。
6．加二抗與一抗的結合
① 根據實驗需要和設計選擇合適的酶標二抗和稀釋濃度（PBS稀釋），每個加樣槽中加入二抗1ml左右室溫下于搖床孵育1h，注意保證膜的所有部分同溶液接觸。