RNaseA／Tl保護和RNaseH聚焦法實驗

胰RNase RNase T1 蛋白酶K

雜交混合液 RNase消化緩沖液

水浴 垂直電泳裝置 暗片盒 X射線片 探針

一、材料與設備

1. 水浴。

2. 垂直電泳裝置。

3. 暗片盒。

4. X 射線片。

5. [ ³²P ] 標記的探針：將探針溶于水中，濃度為 1~2 ng/μl。

6. 雜交混合液：80% 去離子甲酰胺，0.4 mol/L NaCl，40 mmol/L NaPIPESC（pH 6.8 )， 1 mmol/L EDTA。

7. RNase 消化緩沖液：300 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4 )，4 mmol/L EDTA。

8. 胰 RNase：將酶溶于含 10 mmol/L NaCl 的 TE 溶液中，濃度為 10 mg/ml，煮沸 15 min，緩慢冷卻到室溫。溶液分裝小份于 -20℃ 儲存。

9. RNase T1：溶于 TE 中，濃度為 1 mg/ml，調 pH 至 7.0，溶液分裝小份于 -20°C 儲存。

10. 蛋白酶K：將酶溶于水，濃度為 20 mg/ml，分裝小份于 -20℃ 儲存。

二、操作方法

1. 對每份樣品，加 1 μl 探針于 29 μl 雜交混合液中。探針重溶于水，為最終體積的 3%，探針的實際數最并不嚴格，因為探針對特定的目標片段而言是過量的。

2. 將凍干或乙醇沉淀的 10 μg RNA 樣品重懸于 30 μl 完全的雜交液（含探針）。90℃ 加熱 2 min，然后于 45°C 保溫過夜。

3. 將樣品置冰上冷卻，加 300 μl RNase 消化緩沖液。可用胰 RNase 或 RNase T1 或 兩酶共同于 25℃ 消化 1 h。用胰 RNase 切割尿嘧啶或胞嘧啶后面的殘基，RNaseT1 切割鳥嘌呤后面的殘基。

4. 加 20 μl 10% SDS，用 0.5 μl ( 10 μg ）蛋白酶 K 于 37℃ 消化 10~20 min，除去 RNase，用酚：氯仿抽提兩次。加 10 μg 載體 tRNA 后，用乙醇沉淀 RNA。

5. 重懸 RNA 于樣品緩沖液中，90℃ 加熱 2 min 使雜種分子變性。在適當濃度的聚丙烯酰胺-尿素測序膠上電泳，用 20% 乙醇將膠固定，用 10% 乙酸除去尿素后作放射自顯影。