凝膠過濾實驗

實驗步驟

操作

采用分子篩層析獲得的洗脫圖譜如圖 23.1 A 所 75。零 洗 脫 體 積 (zero elution volu m e ) 是指上樣于層析固定相的樣品體積。無法進入介質的分子的洗脫體積定義為無效體 積 V 。，它表示顆粒外部的體積。可以進人介質的分子的體積定義為總體積％, 它表示顆粒內部體積及外部體積的總和。介于兩者之間的洗脫體積即為 V e。分配系 數 為 K av，
具體關系見式 (23.1):

蛋 白 質 分 子 質 量 決 定 分 配 系 數 ，兩 者 之 間 的 半 對 數 曲 線 如 圖 23.1 B 所 示 。基 于 分 子質 量 的 大 小 分 離 蛋 白 質 最 好 在 上 述 S 形 曲 線 的 中 央 線 性 區 域 ，該 區 域 涉 及 的 K av 值 為0.2?0.8。這 一 范 圍 可 以 作 為 分 子 排 阻 介 質 的 分 離 范 圍 。

在 分 離 范 圍 內 ,S 形 曲 線 的 斜 率 越 大 ，表 示 介 質 的 分 辨 率 越 大 。相 應 地 ，在 分 離 分 子質 量 相 似 的 蛋 白 質 時 , 最 宜 采 用 分 離 范 圍 較 窄 的 介 質 。

任 何 一 種 分 子 篩 層 析 柱 可 以 只 從 流 出 液 中 分 離 的 蛋 白 質 均 少 于 1 0 種 。之所以發生這 種 較 低 的 分 辨 率 ，一 是 因 為 在 層 析 過 程 中 , 沒 有 任 何 蛋 白 質 留 存 于 柱 中 ；二 是 因 為 在 顆粒 周 圍 出 現 非 理 想 流 動 。因此 ，如 果 目 標 蛋 白 質 比 混 合 物 中 大 多 數 蛋 白 質 的 分 子 質 量 大或 者 小 ，就 可 能 顯 著 改 善 分 子 篩 層 析 純 化 (倍 數 ) 。 由 于 上 述 情 況 并 不 具 有 普 遍 性 ，研 究 者只 能 期 望 適 度 提 高 純 化 (倍 數 ) 。因 此 ，在 純 化 方 案 中 將 分 子 篩 層 析 盡 量 放 在 純 化 程 序 的后 期 是 明 智 的 ，此 時 其 他 蛋 白 質 數 量 少 , 并 且 前 面 的 步 驟 已 經 采 用 完 全 不 同 特 性 的 方 法 對蛋 白 質 混 合 物 進 行 了 分 離 。例 如 ，經 過 離 子 交 換 層 析 合 并 的 分 離 組 分 ，很 可 能 還 是 一 個 蛋白 質 的 混 合 物 ，它 們 具 有 相 同 的 凈 電 荷 ，只 是 分 子 質 量 不 同 。

1. 介質

一 些 傳 統 的 高 效 分 子 篩 介 質 的 特 性 如 表 23. 1? 表 23. 4 所 示 。需 要 注 意 的 是 ，供 應商 在 其 產 品 目 錄 的 索 引 中 使 用 了 多 種 術 語 及 縮 寫 ，包 括 凝 膠 過 濾 層 析 (gel-filtmtion chrom a t o g r a p h y , G F O 、凝 膠 滲 透 層 析 (gel-permeation chromatography, G P C ) 和 分 子 篩 層析（size-exclusion chromatography, S E C ) 。

傳 統 介 質 具 有 經 濟 性 和 流 速 慢 的 特 點 。這 些 介 質 常 以 散 裝 的 形 式 銷 售 , 研 究 者 可 以根 據 需 要 分 離 樣 品 的 體 積 來 填 裝 任 意 尺 寸 的 層 析 柱 。其 正 常 流 速 如 表 23. 2 所 示 , 體 積 流速 為 柱 橫 截 面 積 (c m 2) 乘 以 線 性 流 速 (m i n /h ) 。填 裝 層 析 柱 的 流 速 大 約 為 層 析 分 離 過 程中 的 5 倍 。

髙 效 介 質 具 有 使 用 方 便 、流 速 快 和 成 本 髙 的 特 點 。這 類 介 質 常 以 填 充 柱 的 形 式 銷 售 ，研 究 者 通 常 可 以 采 用 已 有 的 高 效 層 析 方 法 進 行 純 化 。較 小 的 分 析 型 層 析 柱 大 約 為 8mmX300mm，正 常 情 況 下 其 蛋 白 質 載 荷 量 為 數 毫 克 以 下 ，流 速 為 I m L /m i n 左 右 。更 大 的 制 備型 層 析 柱 的 填 充 顆 粒 的 直 徑 一 般 為 30 um 。20 mm X 300 m m 左 右 規 格 的 層 析 柱 , 其 蛋 白質載荷量為 1 〇?1 〇〇 m g ，操 作 流 速 約 5 m L /m i n 。對 于 非 常 大 的 層 析 柱 來 說 ，其 蛋 白 質 載荷 量 可 以 達 到 2 g ，流 速 可 達 30 m L /m i n 。

2.樣品的制備

樣 品 蛋 白 質 的 濃 度 一 般 不 應 超 過 50 m g /m L ，并 且 應 采 用 離 心 處 理 后 獲 得 的 澄 清 溶液 ，如 有 必 要 ，應 以 低 流 速 上 樣 防 止 不 溶 性 微 粒 形 成 。既 然 在 層 析 分 離 的 過 程 中 ，蛋 白 質預 處 理 后 才 使 用 相 關 的 溶 劑 ，那 么 該 溶 劑 的 使 用 就 是 無 關 緊 要 的 。

3. 層析用溶劑

可 以 用 于 層 析 柱 的 溶 劑 種 類 很 寬 泛 ，只 需 滿 足 如 表 23. 1 中 所 示 的 系 統 規 定 的 參 數 、P H 和 溫 度 等 。但 是 ，蛋 白 質 與 介 質 可 以 通 過 靜 電 作 用 或 范 德 華 作 用 結 合 。為 了 將 結 合降至 最 低 ，所用 溶 劑 的 離 子 強 度 應 不 小 于 0.2 mol/L 。 由 于 大 多 數 蛋 白 質 本 身 在 室 溫 下
是 比 較 穩 定 的 ，而 蛋 白 質 樣 本 中 存 在 的 任 何 蛋 白 水 解 酶 都 會 催 化 多 肽 水 解 ，此 時 只 需 要 降低溫度就可以減慢水解速率。然而，純化階段的蛋白質水解已成為日益突出的問題，因為對于蛋白酶來說，目標蛋白質富集后蛋白酶的作用底物也變得更豐富。在某些情況下，我們還需要向層析溶劑中加人較昂貴的蛋白酶抑制劑或效應物，以便維持目標蛋白質的功能 。也可以采用一些比較經濟可行的方法，用含有昂貴抑制劑組分的溶劑平衡 1 個柱體積 ，之后再進行蛋白質樣品上樣。完成上 樣 之 后 ，溶劑中便不需要加人昂貴的抑制劑組分。

在玻璃圓柱內可以用簡單的溶劑進行層析柱灌裝，如 采 用 含 有 〇.0 2 % 疊氮化鈉的0.1 mol/L NaCl 進行平衡，可以防止微生物的生長。在不銹鋼圓筒中灌裝層析柱, 首選的儲存溶劑為甲醇, 可以避免其中的鹽溶液加速對容器的腐蝕。

4. 初篩

為了優化分子篩層析的純化效果 (倍數），需要采用最容易分離目標蛋白質的介質。同樣的，初篩可以用于估測目標蛋白質的分子質量，以及區分其他蛋白質的分子質量。除了蛋白質樣品外，用于進行初篩的工具還包括分子篩層析柱、分布收集器、總蛋白質含量測定儀器、目標蛋白質含量測定儀器及蛋白質分子質量標準混合物。蛋白質總量的測定可以采用紫外分光光度法或者比色法 (見 182 卷 ，Stoscheck 所 著 第 6 章)。用于上樣的蛋白質樣品濃度必須足夠大，這樣, 洗脫液組分中目標蛋白質功能檢測才具有可信性。可以推 測 ，經過層析分離之后，目標蛋白質濃度至少被稀釋 1 個數量級。

蛋白質分子質量標準混合物通常稱之為凝膠過濾標準，可以向一些供應商購買，包括Bio-Rad Laboratories (Richmond, C A )、 Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway,NJ) 和 Sigma Chemical (St. Louis， MO)。這類用于校準的混合物含有一些經過鑒定的蛋白質，它們各自的分子質量和組分均已知，且具有確定的 V。和 Vt。研究者也可以選擇
已經純化的組分作為校準混合物。葡聚糖藍 (blue dextran) 和 DNA 限制性片段通常用于測定 V。。重要的是，不要利用小分子質量的芳香族或雜環化合物測定 Vt，因為這類分子尤其容易與分子篩層析介質發生可逆性吸附。

如有現成的高效分子篩分析柱和層析方法，那么初篩的工作將會既快速又簡單。用于初篩的層析柱，其分離范圍應比較寬廣。在分析柱前應放置保護柱, 以便截留之前未曾注意到的顆粒性物質。可采用注射方式進行上樣，這樣可以保證上樣體積的最小化，也適合于層析柱流出液中目標蛋白質的分析。如果溶劑的吸光度允許，應采用吸光度流量探測 儀 ，并將檢測波長設置在更靈敏的 225 nm 處以監測流出液的蛋白質濃度，或者也可以設置在相對不太靈敏的 280 nm 處進行監測。若沒有吸光度流量探測儀，應收集流出液組分并分析總蛋白質量及目標蛋白質量。最后 ，將凝膠過濾標準混合物采用注射上樣，并以相同的波長監測流出液。比較凝膠過濾標準混合物、樣品中總蛋白質及目標蛋白質的洗脫圖，可方便選擇介質，并通過該介質優化分子篩層析的純化效率 (倍數)。

如沒有現成的高效分析柱，那么必須采用分離范圍較寬的傳統介質進行初篩。一般應選擇容易進行灌裝成柱的介質。接下來將會詳細說明以傳統介質灌裝層析柱。同樣的, 利用凝膠過濾的標準混合物、樣品總蛋白質和目標蛋白質的洗脫圖進行初篩，借此來確定用于優化分子篩層析純化的介質。

5. 傳統介質層析

用于蛋白質純化的傳統介質的體積一般應為所需分離樣品體積的 30?100 倍 。將灌裝所需量的介質懸浮于層析溶劑中，并將溫度調節至分離操作時所需條件。懸浮液的體積不應超過預計灌裝柱體積的 2 倍 。輕輕搖晃懸浮液除去細小顆粒，吸去上清液, 直至約9 0 % 顆粒已沉降穩定。最后, 將重懸物放置于負壓條件下以減少溶解空氣的體積。用抽濾瓶和實驗室抽吸器均可以達到此目的。

如介質呈干粉狀，那么在去除細小顆粒前，應先將其溶脹于層析溶劑中。該介質可以在 室 溫 或 l 〇〇° C 條件下溶脹，這取決于研究者可利用的時間。如 表 23. 2 所 示 ，在不破壞介質的前提下，于 l 〇〇° C 下溶脹介質更快。

層析柱制備應在商業化設計的或實驗室臨時制作的玻璃或透明塑料的圓筒中進行。該圓筒長度與直徑的比例一般為 20?100。臨時制作可采用如下程序。柱子的底部可以放置一個末端較窄、長度較短且較厚的橡皮塞, 同時周圍以毛細管圍繞。垂直放置圓筒,并將其安全地置于將進行層析分離操作的位置。將橡皮塞插人圓筒末端底部。以可彎曲的短管與突出的玻璃管連接, 并將夾卡裝置附于管道上控制通過圓筒柱液體的流速。再將一個酰胺纖維或聚四氟乙烯樹脂材料的網狀物放入圓筒柱內部，并推至底部使其正好與橡皮塞相互接觸。關緊夾卡裝置，向圓筒柱中倒入介質懸浮液。過量的懸浮液則位于底部有出口和開關裝置的容器，如分液漏斗中, 且該出口要以一個可彎曲的管道與圓筒柱的頂端和帶有短玻璃管孔的橡皮塞相連。這種組裝設備，在分液漏斗中懸浮液的表面和接于圓柱體底部的可彎曲管道間是封閉的。液體的流速通過與圓筒柱分液漏斗的相對高度進行控制。裝柱時的流速可采用 5 倍 于 表 23. 2 所示的流速 。 一 旦填裝好層析柱所需髙度 ，便可關閉夾子和開關, 去除多余的介質懸浮液，并以分液漏斗作為容器使層析用溶劑流穿層析柱。應使層析柱溶劑頂端一直維持在數厘米的高度，以緩沖加人層析溶劑時產生的沖擊力，進而保證已經填裝好的層析柱頂端不受影響。切記不要使填裝好的層析柱變干，因為這樣會在層析柱中形成通道，進而嚴重影響蛋白質的分離。

上樣時應關閉開關，移除圓筒柱頂端的橡皮塞，且將匯集于圓筒柱頂端的溶劑排過層析 柱 ，直至溶劑浸人已裝層析柱頂端之下。之后，關閉夾子，將樣品或標準溶液小心加入，盡量減少對已裝層析柱頂端的影響。接著，打開夾子，使樣品溶液進入層析柱內，直至其恰好低于層析柱的頂端。再關閉夾子, 并加入少量的層析用溶劑，注意盡量減少對已裝層析柱頂端的影響。溶劑進入層析柱后，再關閉夾子，加入更多的層析溶劑，以形成所需的溶劑高度。用分液漏斗供給層析溶劑, 并通過可彎曲的管道密封連接于層析柱的頂端。最后調整分液漏斗的髙度并維持所需流速。

柱后流出液的吸光度可以通過流量控制器在所需波長下進行連續監控。重要的是，層析柱底部的管狀材料和監控器中的流動光學元件均應具有較小的直徑，這樣可以防止在層析柱中出現液體的對流混合現象。還有一點也是很重要的，所用的可彎曲管道，其材料對層析溶劑的紫外線吸光度值應無影響。另 外 ，柱后流出液還可以通過分級收集器直接收集, 之后，再進行分離組分的總蛋白質和目標蛋白質的分析檢測。滴數計是可以達到這一目的的理想工具。

6. 放大

采 用 傳 統 介 質 進 行 分 子 篩 層 析 很 容 易 放 大 規 模 ，可 以 增 大 柱 體 積 以 適 應 需 分 離 純 化的 樣 品 體 積 。樣 品 體 積 非 常 大 時 ，相 對 于 制 備 極 大 尺 寸 層 析 柱 來 說 ，最 好 的 處 理 辦 法 是 重復 層 析 。表 23. 4 所 示 為 可 購 買 的 半 制 備 用 或 制 備 用 規 模 的 髙 效 層 析 柱 ，并 且 有 些 供 應 商也 會 為 研 究 者 提 供 散 裝 介 質 用 于 灌 裝 層 析 柱 。盡 管 這 類 較 大 的 高 效 層 析 柱 十 分 昂 貴 ，但是 可 以 為 研 究 者 節 省 相 當 多 的 時 間 ，而 且 還 有 多 種 不 同 的 用 途 ，故 而 從 長 期 來 看 ，這 種 投資 還 是 值 得 的 。

7. 故障排除

分辨率低

分 辨 率 低 是 使 用 者 普 遍 的 感 受 ，因 為 分 子 篩 層 析 本 身 就 存 在 分 辨 率 差 的 缺 點 。雖 然如 此 , 還 是 可 以 通 過 改 變 一 些 操 作 參 數 來 提 高 分 辨 率 。首 先 ，由 于 流 速 與 分 辨 率 呈 反 相關 , 故 降 低 流 速 可 以 提 高 分 辨 率 。其 次 ，采 用 直 徑 更 小 的 顆 粒 可 以 提 高 分 辨 率 。最 后 ，采用 分 離 范 圍 更 窄 的 介 質 也 許 會 有 幫 助 。

流速慢
流 速 慢 通 常 是 由 于 樣 品 中 存 在 的 顆 粒 物 質 堵 塞 了 過 濾 裝 置 或 層 析 介 質 。處 理 方 法 ：首 先 采 用 反 向 流 清 洗 層 析 柱 ，配 以 增 溶 性 的 試 劑 ，如 離 子 型 或 非 離 子 型 的 去 污 劑 ; 蛋 白 質變 性 劑 ，如 尿 素 或 鹽 酸 胍 ; 有 機 溶 劑 ，如 甲 醇 ; 或 者 在 保 證 介 質 穩 定 的 前 提 下 , 將 其 短 暫 暴露 于 強 酸 或 強 堿 。如 上 述 的 操 作 仍 不 能 達 到 效 果 ，對 于 傳 統 介 質 , 建 議 拆 分 層 析 柱 ，分 別進 行 清 洗 ，之 后 再 重 裝 ; 對 于 高 效 層 析 柱 ，建 議 可 將 該 層 析 柱 送 至 P h e n o m e n e x 或 其 他 供應 商 處 ，進 行 有 償 清 理 及 重 裝 ，或 者 采 用 簡 單 的 方 式 用 新 的 層 析 柱 進 行 替 換 。具 有 重 裝 層析 柱 設 備 的 實 驗 室 也 可 自 己 進 行 清 潔 并 重 裝 高 效 層 析 柱 。

色 譜 峰 傾 斜

色 譜 峰 傾 斜 主 要 是 由 上 樣 不 正 確 所 引 起 的 。對 于 傳 統 層 析 柱 , 上 樣 時 可 加 人 惰 性 有色 組 分 以 監 測 樣 品 質 量 ，如 葡 聚 糖 藍 或 重 鉻 酸 鉀 。如 果 樣 品 在 層 析 柱 中 的 出 現 不 規 律 ，那么 在 洗 脫 圖 中 將 會 出 現 不 對 稱 峰 。高 效 層 析 柱 的 進 樣 器 可 以 拆 卸 并 清 洗 。拖 尾 峰 一 般 因蛋 白 質 與 介 質 的 吸 附 所 致 。這 種 情 況 是 可 以 改 善 的 ，通 過 將 更 易 溶 的 鹽 作 為 層 析 溶 劑 中的 主 要 離 子 組 分 ，如 高 氯 酸 鈉 代 替 氯 化 鈉 。在 使 用 高 效 層 析 柱 時 ，如 出 現 拖 尾 現 象 ，則 表明 二 氧 化 硅 顆 粒 的 包 被 材 料 損 耗 過 大 ，需 要 改 換 層 析 柱 。斜 峰 也 可 能 是 因 蛋 白 質 聚 合 的不 同 狀 態 間 的 可 逆 平 衡 所 致 。例 如 ，血 紅 蛋 白 可 以 呈 現 二 聚 體 和 四 聚 體 間 的 動 態 平 衡 。既 然 聚 合 作 用 主 要 圍 繞 蛋 白 質 分 子 質 量 而 變 化 , 那 么 介 質 就 要 有 助 于 解 離 , 而 化 學 平 衡 有助 于 聚 合 。對 于 這 種 動 態 互 換 ，這 些 相 反 的 作 用 力 就 會 引 發 斜 峰 出 現 。層 析 溶 劑 的 p H 、溫 度 或 化 學 組 分 的 改 變 也 可 能 使 化 學 平 衡 發 生 變 化 ，進 而 導 致 僅 一 種 多 聚 體 顯 著 增 加 。

目標蛋白質消失

至少有兩個原因會導致這種現象發生。第一個原因是目標蛋白質與層析柱介質適度結 合 ，洗脫峰范圍較寬，導致洗脫的目標蛋白質出現于 V t 之后 ，很難將其與基線噪聲區分 。若發生這種情況，應將蛋白質的增溶劑，如非離子型去污劑或適當濃度的蛋白質變性劑加入至層析溶劑。第二個原因是功能性蛋白質復合物分解為不同分子質量的離散蛋白質 ，這些離散蛋白質本身不能維持其原有功能。將不同組分混合也許有助于各組分蛋白質的絡合，進而使其功能得到恢復。

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