振蕩搖床法純化培養少突膠質細胞實驗

利用少突膠質細胞、星形膠質細胞和小膠質細胞生長存存時間上的差異，以及細胞生長方式、細胞對培養層黏附性不同等特性，用37℃恒溫搖床從培養的混合膠質細胞中分離少突膠質前休細胞，然后再利用差速貼壁的原理用塑料培養皿或培養瓶除去純化后污染的星形膠質細胞以獲得高純度的少突膠質細胞，并在體外誘導分化的條件下最終獲得成熟的少突膠質細胞。

新生1-2d的SD大鼠仔鼠

DMEM培養液(l1960).DMEM F12培養液 胎牛血清 3. 胰島素(16634).轉鐵蛋白(T2252) 谷氨酰胺(G8540) 丙酮酸鈉(P2256).牛血清白蛋白(A9647) 硒酸鈉(S5261) 氫化可的松(H0888) 三碘甲腺原氨酸(T-2752) NAC(A8199)、多聚鳥氨酸(P042l) DNase l(D5025)以上Sigma公司

培養瓶 37℃恒溫搖床

原代培養來自于新生1-2d的SD大鼠皮層的少突膠質細胞。

依照總論的方法獲得細胞懸液后，參考文獻 (NatureProtocols,2007,2:I044-I051; Journalof Neuroscience Methods,2005,50-56) 介紹的方法，詳細步驟如下。

1.在離心獲得的細胞沉淀中，加入1.5ml的培養液并用小口徑滴管輕柔重懸細胞，再用完全培養基(DMEM+10%胎牛血清+1mM的丙酮酸鈉+4mM的谷氨酰胺+50U/ml青霉素）稀釋，按照1.0x10⁵/cm²的密度接種于多聚賴氨酸包被的T75的培養瓶中，混勻后放入37℃,5%CO₂的孵育箱內培養。

2.接種2d之內盡量不要晃動培養瓶，培養4d后開始全量換液，以后每3d全量換液1次并注意鏡下觀察細胞融合度。

3培養至第7-9天時，星形膠質細胞已鋪滿瓶底，并且可見其上層有胞體小、折光高、有小突起的少突前體細胞出現，此時可以開始純化細胞。

4先用搖床除去處于半懸浮生長的小膠質細胞(200r/min,37℃,約20min),然后快速全拯換液。

5換液過夜穩定后繼續用搖床分離少突前體細胞(280r/min,37℃),18-20h后收集細胞懸液并使其通過200目的細胞篩網，然后再利用差速貼壁除去混入的星形膠質細胞和小膠質細胞（將過濾的細胞懸液接種于100mm培養皿[Corning, NY]內靜置，每隔5min用手輕輕搖晃1次，連續持續30min),剩余培養瓶中的細胞可以加新鮮完全培養液繼續培養3d,然后重復5的步驟。

6.收集培養皿中的細胞上清并計數，離心(1000r/min,5min)后棄上清，以少突前體細胞增殖培養基（無血清培養基Satomedium中添加10ng/ml PDGF-AA和10ng/ml bFGF)重懸細胞，并按照(3-4)x10⁴/cm²密度接種于多聚鳥氨酸包被的培養皿或玻片上，每天補充半量的增殖因子(PDGF-AA和bFGF)

7. 2-3d后細胞增殖至鋪滿培養皿時可用消化分離培養液(DMEM/F12中添加0.01%EDTA、0.2mg/ml DNase I溶液、5μg/ml胰島素）消化細胞（直接吸棄培養液并加入少量消化液，手心中搖晃5-8min),利用含血清培養液終止消化，仔細吹打培養皿底部，使全部細胞脫落，然后收集細胞上清離心。

8.傳代1次的細胞可以繼續接種于增殖培養基中，也可以接種千分化培養基內［無血清培養基Satomedium中添加15nM三碟甲腺原氨酸(T3)、10ng/ml CNTF和5μg/ml NAC]開始誘導少突膠質細胞分化。此后每隔Id補充半量的促分化因子(T3、CNTF和NAC),在分化培養基中培養2d后可以獲得未成熟的少突膠質細胞，在培養6d后可以獲得成熟的少突膠質細胞。無血清培養基Satomedium制備：在DMEM/F12中添加4mM谷氨酸、0.1mM丙酮酸鈉、0.1%BSA、50μg/ml轉鐵蛋白、5μg/ml胰島素、30nM硒酸鈉、10nM維生素H和10nM氫化考的松。少突膠質細胞的細胞體較星形膠質細胞和小膠質細胞的小，少突前體細胞的為雙極突起，隨著分化成熟，突起分支增多，呈蛛網狀（圖I-4)。在少突膠質細胞分化成熟過程中特異性表達一系列的標記物，從而可以根據不同的標記物鑒別少突膠質細胞及所處的分化階段

1.選擇新生1-2d的仔鼠培養少突膠質細胞。年齡稍微偏大的仔鼠中星形膠質細胞數量過多，偏小的仔鼠中神經元數量多，都不適宜培養少突細胞。

2.原代培養時接種的密度不宜過小（一般2-3只新生鼠皮層的細胞接種于一個T75的培養瓶中），否則很難獲得足夠數量的少突膠質細胞。

3用搖床單次純化OPCs的時間不宜超過24h,否則容易導致細胞活性下降。

4.培養少突膠質細胞的無血清培養基中最好不要添加鏈霉素，有報道認為鏈霉素對少突膠質細胞的活性有一定的影響。另外配制的含各種神經因子的無血清培養基最好在2周內用完。

5少突膠質細胞在堿性環境中生長不佳，要注意CO₂孵育箱內的酸堿度。

1. 搖床震搖細胞過夜一般從下午或晚上開始，次日一大早應先觀察細胞脫壁情況，防止時間過長下層細胞發生脫壁。

2. 小鼠的少突膠質細胞培養用該方法通常獲得的少突前體細胞不易誘導分化為成熟的細胞，可以參考其他方法培養(NatureProtocols,2007,2:1044-I051)。

3. 少突膠質細胞是一種極易損傷、不易存活的細胞，在較為復雜的培養過程中要特別注意每個細節。目前用于誘導少突膠質細胞分化的無血清培養基的有DF12+Nl/N2+T3（少突膠質細胞在這種培養基中的存活時間短，需要的細胞接種密度高）、Neuro-basal medium+B27+T3（利于細胞存活，支持低密度接種的細胞，并且能夠與神經元共培養，但是少突膠質細胞成熟的過程較慢）和Satomedium (少突膠質細胞獨立培養最為公認的培養基，利于細胞的成熟分化）。可以根據各自的實驗要求選擇不同的培養方法。另外，少突膠質細胞成熟后在沒有神經元軸突刺激的情況下，無法形成髓鞘，會逐漸凋亡而不會長時間存活。