Cell|修復與癌變：呼吸道神經內分泌細胞的干細胞功能

　　在生物發育過程中，分化往往被認為是不可逆的過程。生物為應對部分組織的快速更新，往往在發育過程中選擇保留一部分低分化的干細胞，如骨髓和皮膚中存在的造血干細胞和表皮干細胞。但對于更新緩慢的大多數其他組織，典型意義上的干細胞往往難覓蹤跡。相反，這類組織經常選擇利用部分分化程度較高并具有特定生理功能的細胞來完成組織修復或更新工作【1】，而這部分僅在特定條件下具有部分干細胞特性和轉分化（Transdifferentiation）能力的細胞在發育生物學研究中往往不能得到足夠的重視。

　　在哺乳動物呼吸道上皮中，負責上皮損傷修復工作的一類神經內分泌（Neuroendocrine，NE）細胞便具有上述細胞的特性。這類細胞呈簇分布在呼吸道上皮中，負責感知呼吸道內的刺激信號并將信號傳導至下游的感覺神經元。由于在形態上與周圍的纖毛柱狀上皮相近并在發育譜系上與上皮細胞同源，這類NE細胞形成的結構被稱為神經上皮小體（Neuroepithelial Body，NEB）。NE細胞在生理條件下極少增殖，但在呼吸道損傷過程中則可以迅速通過增殖和轉移分化完成對損傷上皮的修復【2,3】。雖然人們對NE細胞的參與上皮修復的功能已經有了初步的了解，但對其中的具體機制則缺乏清晰的認識。

　　近日，美國斯坦福大學Mark A. Krasnow教授領導的研究小組在Cell雜志上，發表了題為Rare pulmonary neuroendocrine cells are stem cells regulated by Rb, p53, and Notch的文章，對NE細胞完成呼吸道上皮修復的機制進行了深入研究。

　　在研究中，作者利用神經生物學研究中常用的彩虹熒光（Rainbow Fluorescence）標記方法對NE細胞進行了標記，并觀察了上皮損傷后NE細胞的反應。利用胸苷類似物EdU，作者識別了損傷后出現增殖的NE細胞，并發現在每個NEB結構中只有少部分（約30%）細胞發生了增殖，且在每次損傷中出現增殖的為同一NE細胞亞群。這證明了在NEB中存在一部分特定的、具有干細胞功能的NE（NEStem）細胞參與損傷修復過程。除細胞增殖外，作者同時發現在上皮損傷后一部分（約15%）NE細胞會產生細胞遷移和擴散，向脫離NEB的方向產生“滑行”（Slithering）。NE細胞的上述增殖和擴散過程發生在損傷后的一周內，在此期間增殖和擴散的細胞都保持著NE細胞特性，證明損傷后短時間內NEStem細胞僅完成了自我更新（Self-renewal）而并未完成去分化。在此后的兩周內，NEStem細胞會在NEB周圍形成大面積的再生上皮，完成損傷修復。有趣的是，每個NEB周圍的再生上皮均來自同一個NEStem細胞的單克隆增殖，而這一階段新生的上皮細胞也不再表達NE細胞標志物Calcitonin Gene-Related Peptide（CGRP），顯示NEStem細胞此時已經完成了轉移分化的過程（圖1）。

圖1 NE細胞介導的呼吸道上皮損傷修復過程

　　為研究調控損傷修復過程的分子機制，作者對NE細胞和周圍上皮細胞進行了單細胞RNA測序，并依據測序結果分析了調控修復過程的信號通路。利用基于T-distributed Stochastic Neighbor Embedding （t-SNE）的RaceID2算法【4】，作者對流式分離得到的225個NE或上皮細胞的表達譜進行了聚類分析（Clustering），并發現了五種不同類型的細胞。在NE來源的100個細胞中，95個被歸類為NE細胞類型，而另外5個則分屬于其他四種類型，證明在損傷修復過程中一部分NE細胞完成了轉移分化。利用主成分分析（Principal Components Analysis，PCA）的方法，作者發現了包括上述5個細胞在內的8個NE來源的細胞具有“過渡”細胞（”Transitional” Cell）的特性，即低表達NE標記基因Resp18并高表達呼吸道上皮標記基因Cbr2。通過進一步分析，作者發現在225個細胞中Notch信號通路轉錄因子Hes1的表達與Cbr2的表達高度相關，而在對更多NE來源細胞的分析中也發現了Hes1陽性的細胞亞群。由此，作者猜測Notch通路在NEStem細胞修復上皮損傷過程中起到了關鍵作用。

　　接下來作者證明了Notch通路在損傷修復過程中對NEStem細胞去分化的作用。在生理條件下，NEB中無法檢測到Notch通路激活的細胞，而在損傷刺激后Hes1陽性細胞則逐漸出現。Hes1陽性細胞通常出現在NEB的外周部位，預示著激活NEStem細胞修復功能的信號可能來源于NEB周圍的損傷上皮組織。抑制NE細胞的Notch通路會嚴重影響損傷修復的進程，而激活Notch通路則可以在沒有損傷的情況下誘導NE細胞去分化。這一結果證明Notch通路對于NEStem細胞的去分化過程至關重要，但作者同時發現，Notch通路的激活并不能誘導去分化的NEStem細胞完成增殖和再分化為上皮細胞。

　　在關注Notch通路的過程中，作者注意到Notch通路的激活發生在NEStem細胞自我更新過程之后，而且調節Notch通路也不能影響損傷修復初始階段NEStem細胞的自我更新和擴散過程。其他研究表明，NE細胞在Rb/p53功能缺失的條件下可以恢復增殖功能并發展為小細胞肺癌（Small Cell Lung Cancer, SCLC）【2,5】，由此作者猜測Rb/p53信號通路可能調控了損傷初期NEStem細胞的增殖和自我更新過程。在接下來的研究中，作者發現敲除Rb和p53基因會導致部分NE細胞在非損傷條件下出現增殖，而Rb/p53缺失誘導的增殖NE細胞與損傷過程中激活的NEStem細胞高度重合。二者不同之處在于， NEStem細胞在完成有限的增殖后會恢復靜默狀態，而Rb/p53缺失誘導的增殖過程則不會恢復。此外，Rb/p53缺失的NEB中會有更多的NE細胞出現增殖。而在后續的上皮修復過程中，Rb/p53缺失的NE細胞修復的上皮組織的范圍也更大。有趣的是，雖然Rb/p53缺失會誘導NE細胞的過度增殖和上皮的過度修復，但沒有損傷的條件下Rb/p53缺失的NE細胞不會產生上皮修復過程中的增殖和分化。

　　通過對上述信號通路的研究，作者進一步描繪了呼吸道上皮損傷后NEStem細胞作為干細胞參與上皮修復的分子機制。在上皮損傷后，NEStem細胞將接收多個不同的信號完成損傷修復過程。首先，受到損傷細胞會產生信號抑制NEStem細胞中Rb/p53的活性，使NEStem細胞完成增殖和自我更新。與此同時，另一信號會誘導NEStem細胞產生遷移和擴散。在此之后， NEStem細胞的Notch通路將被激活，從而誘導NEStem細胞完成去分化過程，并在后續信號的引導下完成過渡放大（Transit Amplification）和再分化過程并修復損傷的上皮細胞（圖2）。

圖2 NEStem細胞在修復上皮損傷與癌變過程中的信號通路

　　綜上，作者通過本文的研究從形態上具體描述了NE細胞修復呼吸道上皮損傷的過程，并闡釋了其中的分子機制。這一發現加深了人們對具有干細胞特性的高分化細胞實現干細胞功能的機制的理解。另一方面，本文也驗證了Rb/p53這一抑癌通路對NE細胞增殖的影響，從而支持了人們對NE細胞作為小細胞肺癌組織來源的認識。由此，本文也提示了上皮損傷在小細胞肺癌進展過程中的重要誘導作用，而本文闡述的NE細胞修復上皮損傷的機制也對研究小細胞肺癌早期發展的機制具有借鑒意義。

　　原文鏈接：

　　https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.09.010

　　參考文獻

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　　4. Grun, D., Muraro, M.J., Boisset, J.C., Wiebrands, K., Lyubimova, A., Dharmadhikari, G., van den Born, M., van Es, J., Jansen, E., Clevers, H., et al. (2016). De Novo Prediction of Stem Cell Identity using Single-Cell Transcriptome Data. Cell Stem Cell 19, 266-277.

　　5. Sutherland, K.D., Proost, N., Brouns, I., Adriaensen, D., Song, J.Y., and Berns, A. (2011). Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell 19, 754-764.