淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體技術
| 實驗方法原理 |
1975年，Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫學與生物學基礎研究開創了新紀元，也為臨床疾病的診、防、治提供了新的工具。 制備單克隆抗體包括動物免疫、細胞融合、選擇雜交瘤、檢測抗體、雜交瘤細胞的克隆化、凍存以及單克隆抗體的大量生產，要經過幾個月的一系列實驗步驟。 |
|---|---|
| 實驗材料 | 小鼠 骨髓瘤細胞 |
| 試劑、試劑盒 | NCS |
| 儀器、耗材 | CO2孵箱 培養板 |
| 實驗步驟 |
一、細胞融合前準備
1. 免疫方案
選擇合適的免疫方案對于細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般要在融合前兩個月左右確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。
（1）顆粒性抗原免疫性較強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。下面以細胞性抗原為例的免疫方案
初次免疫 1×107/0.5 ml ip （腹腔內注射） ↓ 2～3周后 第二次免疫 1×107/0.5 ml ip ↓ 3周后 加強免疫（融合前三天）1×107/0.5 ml ip或iv（靜脈內注射） ↓ 取脾融合
（2）可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐劑，常用佐劑：福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑。要求抗原和佐劑等體積混合在一起，研磨成油包水的乳糜狀，放一滴在水面上不易馬上擴散呈小滴狀表明已達到油包水的狀態。商品化福氏完全佐劑在使用前須振搖，使沉淀的分枝桿菌充分混勻。
初次免疫 Ag 1～50 μg 加福氏完全佐劑皮下多點注射（一般0.8～1 ml 0.2 ml/點） ↓3周后 第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（ip劑量不宜超過0.5 ml） ↓3周后 第三次免疫 劑量同上，不加佐劑，ip（5～7天后采血測其效價，檢測免疫效果） ↓2～3周后 加強免疫，劑量50～500 μg為宜，ip或iv ↓3天后 取脾融合
目前，用于可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如
2. 飼養細胞 在制備單克隆抗體過程中，許多環節需要加飼養細胞，如：在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或小鼠胸腺細胞，也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射后作為飼養細胞，使用比較方便，照射后可放入液氮罐長期保存，隨用隨復蘇。
小鼠腹腔巨噬細胞的制備
小鼠采用與免疫小鼠相同的品系，常用BaLb/c小鼠6～10 周齡 ↓ 拉頸處死，浸泡于75 ％酒精，消毒3～5 分鐘 ↓ 用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜 ↓ 用無菌注射器注入6～8 ml培養液 ↓ 反復沖洗，吸出沖洗液 ↓ 放入10 ml離心管，1200 轉/分離心5～6 分鐘 ↓ 用20 ％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數1×105 /ml ↓ 加入96孔板，100 μl/孔 ↓ 放入37 ℃，CO2孵箱培養
一般飼養細胞在融合前一天制備，一只小鼠可獲得5～8×106 腹腔巨噬細胞，若用小鼠胸腺細胞作為飼養細胞時，細胞濃度為5×106 /ml，小鼠脾細胞為1×106 /ml，小鼠的成纖維細胞（3T3）1×105 /ml，均為100 μl/孔。
3. 骨髓瘤細胞
骨髓瘤細胞系應和免疫動物屬于同一品系，這樣雜交融合率高，也便于接種雜交瘤細胞在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。
常用骨髓瘤細胞系有：NS1、SP2/0、X63 Ag8.653等。
骨髓瘤細胞的培養適合于一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10～20 ％，細胞的最大密度不得超106 /ml，一般擴大培養以1∶10稀釋傳代，每3～5 天傳代一次。細胞的倍增時間為16～20 小時，上述三株骨髓瘤細胞系均為懸浮或輕微貼壁生長，只用彎頭滴管輕輕吹打即可懸起細胞。
一般在準備融合前的兩周就應開始復蘇骨髓瘤細胞，為確保該細胞對HAT的敏感性，每3～6月應用8～AG（8氮雜鳥嘌呤）篩選一次，以防止細胞的突變。
保證骨髓瘤細胞處于對數生長期，良好的形態，活細胞計數高于95 ％，也是決定細胞融合的關鍵。
4. 免疫脾細胞
免疫脾細胞指的是處于免疫狀態脾臟中B淋巴母細胞和漿母細胞。一般取最后一次加強免疫3天以后的脾臟，制備成細胞懸液，由于此時B淋巴母細胞比例較大，融合的成功率較高。
脾細胞懸液的制備
二、細胞融合，選擇雜交瘤
1. 細胞融合流程
（1）取對數生長的骨髓瘤細胞SP2/0，1000 rpm離心5 分鐘，棄上清，用不完全培養液混懸細胞后計數，取所需的細胞數，用不完全培養液洗滌2 次。
（2）同時制備免疫脾細胞懸液，用不完全培養液洗滌2 次。
（3）將骨髓瘤細胞與脾細胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50 ml塑料離心管內不完全培養液洗1 次，1200 rpm，8分鐘。
（4）棄上清，用滴管吸凈殘留液體，以免影響PEG的濃度。
（5）輕輕彈擊離心管底，使細胞沉淀略加松動。
（6）在室溫下融合
①30 秒內加入預熱的1 ml45 ％PEG（Merek，分子量4000）含5 ％DMSO，邊加邊攪拌。 ②作用90 秒鐘，若冬天室溫較低時可延長至120 秒鐘。 ③加預熱的不完全培養液，終止PEG作用，每隔2 分鐘分別加入1 ml，2 ml，3 ml，4 ml，5 ml和10 ml。
（7）離心，800 rpm，6 分鐘。
（8）棄上清，先用6 ml左右20 ％小牛血清RPMI1640輕輕混懸，切記不能用力吹打，以免使融合在一起的細胞散開。
（9）根據所用96孔培養板的數量，補加完全培養液，10 ml一塊96孔板。
（10）將融合后細胞懸液加入含有飼養細胞的96孔板，100 μl/孔，37 ℃、5 ％CO2孵箱培養。
一般一塊96孔板含有1×107脾細胞。
2. HAT選擇雜交瘤
一般在融合24 小時后，加HAT選擇培養液。HT和HAT均有商品化試劑50×貯存，用時1 ml加入50 ml20 ％小牛血清完全培養液中。
因為在培養板內已加入飼養細胞、融合后的細胞，200 μl/孔。所以在加選擇培養液時應加3倍量的HAT。我們認為，融合后最初補加的量可用全量的2/3進行選擇，可得到滿意的篩選結果。
50×HAT H: 5×10-3M A: 2×10-5M T: 8×10-4M
一般選擇HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液。
三、抗體的檢測
篩選雜交瘤細胞通過選擇性培養而獲得雜交細胞系中，僅少數能分泌針對免疫原的特異性抗體。一般在雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。
檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。
常用的方法有
1. ELISA用于可溶性抗原（蛋白質）、細胞和病毒等McAb的檢測。
2. RIA用于可溶性抗原、細胞McAb的檢測。
3. FACS（熒光激活細胞分類儀）用于檢查細胞表面抗原的McAb檢測。
4. IFA用于細胞和病毒McAb的檢測。
上述方法均為一般實驗室的常規方法，故在此不介紹具體的實驗過程。
可靠的篩選方法必須在融合前建立，避免由于方法不當貽誤整個篩選時機。
四、雜交瘤的克隆化和凍存 克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。經過HAT篩選后的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞；所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開，就需要克隆化。克隆化的原則是，對于檢測抗體陽性的雜交克隆應盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。
1. 克隆化方案 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀釋和軟瓊脂平板法。
（1）有限稀釋法的程序 ①制備飼養細胞懸液（同融合前準備） ②陽性孔細胞的計數，并調細胞數在1～5×103 /ml ③取130
個細胞放入6.5 ml含飼養細胞完全培養液，即20 個細胞/ml，100 μl/孔加A、B、C三排為每孔2 個細胞。余下2.9
ml細胞懸液補加2.9 ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數為10 個/ml，100 μl/孔加D、E、F三排，為每孔1 個細胞。余下2.2
ml細胞懸液補加2.2 ml含飼養細胞的完全培養液，細胞數5 個/ml，100 μl/孔，加G、H兩排，為每孔0.5 個細胞。 ④培養4～5天后，在倒置顯微鏡上可見到小的細胞克隆，補加完全培養液200 μl/孔。 ⑤第8～9天時，肉眼可見細胞克隆，及時進行抗體檢測。 注：初次克隆化的雜交瘤細胞需要在完全培養液中加HT。
（2）軟瓊脂法 ①軟瓊脂的配制 含20 ％FCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640 1 ％瓊脂水溶液：高壓滅菌，42 ℃預熱。 0.5 ％瓊脂：由1份1 ％瓊脂加1份含20 ％小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配制而成。置42 ℃保溫。
2. 雜交瘤細胞的凍存
及時凍存原始孔的雜交瘤細胞、每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則因為上述的意外而全功盡棄。
雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以凍一支安瓿。
細胞凍存液： 50％小牛血清 40％不完全培養液 10％DMSO（二甲亞砜）
凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降到0 ℃，再降溫時一般按每分鐘降溫2～3 ℃，待降至-70 ℃可放入液氮中。或細胞管降至0 ℃ 后放-70 ℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可以用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復蘇，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。
五、單克隆抗體的大量生產
大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種
1. 體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從上清中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液含量為10～60 μg/ml，如果大量生產，費用較高。
2. 體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。
（1）實體瘤法
（2）腹水的制備
六、單克隆抗體的鑒定
對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的。應對其做如下方面的鑒定
1. 抗體特異性的鑒定
2. McAb的Ig類與亞類的鑒定
3. McAb中和活性的鑒定
4. McAb識別抗原表位的鑒定
5. McAb親和力的鑒定
展開 |
| 注意事項 |
一、影響因素、失敗原因分析
由于制備McAb的實驗周期長，環節多，所以影響因素就比較多，稍不注意就會造成失敗。
其主要失敗原因和影響因素有
1. 污染
2. 融合后雜交瘤不生長
3. 雜交瘤細胞不分泌抗體或停止分泌抗體
三要 要大量保持和補充液氮凍存的細胞原管。 要定期進行再克隆。 不要讓細胞“過度生長”。因為非分泌的雜交瘤細胞將成為優勢，壓倒分泌抗體的雜交瘤細胞。 不要讓培養物不加檢查地任其連續培養幾周或幾個月。 不要不經克隆化而使雜交瘤在機體內以腫瘤生長形式連續傳好幾代。
4. 雜交瘤細胞難以克隆化 可能與小牛血清質量、雜交瘤細胞的活性狀態有關，或由于細胞有支原體污染，使克隆化難以成功。若是融合后的早期克隆化，應在培養液加HT。
展開 |
當地時間2024年2月16日，美國生物技術公司IovanceBiotherapeutics（IOVA.US）宣布，美國食品藥品監督管理局（FDA）已加速批準Lifileucel（商品名：AMTAGVI......
根據《放射工作人員健康要求及監護規范》（GBZ98—2020）所有放射工作人員在上崗前、離崗時、應急/事故照射時，都必須進行人外周血淋巴細胞染色體畸變分析；從2016年開始全區放射體檢機構陸續來內蒙疾......
CellReports在線發表了中國科學院上海營養與健康研究所邱菊研究組與上海交通大學合作，完成了題為Setd2determinesdistinctpropertiesofintestinalILC3......
近日，中國科學院合肥物質科學研究院健康與醫學技術研究所研究員江力瑋與美國哈佛醫學院移植研究中心主任RezaAbdi合作，在淋巴結內基質細胞的結構和功能領域取得進展，發現了淋巴結基質細胞的一個新亞群，相......
兒童急性淋巴細胞白血病（acutelymphoblasticleukemia,ALL）是最常見的兒童腫瘤性疾病。雖然近年來治療方法的改進顯著提高了患者的5年生存率，但是由于部分患者化療耐藥后復發，其仍......
脊椎動物的B淋巴細胞和T淋巴細胞在發育過程中會通過V(D)J重排產生多樣化的細胞表面受體來識別外來抗原，參與機體的適應性免疫過程。這些在基因組上串聯分布的V、D、J片段兩端帶有重組信號序列（Recom......
MustangBio是一家臨床階段的生物制藥公司，專注于將當今細胞和基因治療方面的的醫學突破轉化為對血液癌癥、實體瘤、罕見基因疾病的潛在治愈。近日，該公司宣布，評估CD20靶向自體CAR-T細胞療法M......
中國科學技術大學田志剛院士、彭慧和孫汭教授與法國學者合作，首次發現成年肝臟造血前體細胞向1型天然淋巴細胞（肝臟定居NK細胞）的分化潛能及調控機制，揭示天然淋巴細胞骨髓外發育新路徑，為闡釋肝臟天然免疫優......
近日，研究人員在CellPress細胞出版社旗下期刊BiophysicalJournal上報告說，一種被稱為細胞毒性T淋巴細胞（CTL）的白細胞能在組織中挖掘隧道，有可能使其他......
人體免疫細胞源自一個共同的血液干細胞祖先，但不同類型的免疫細胞發展自不同的未成熟前體細胞。《中國科學報》從沃爾特和伊萊莎霍爾學院獲悉，該機構研究人員利用單細胞多組學技術發現了一......