肌球蛋白的純化
DEAE純化肌肉肌球蛋白
| 實驗材料 | 冷凍肌肉 |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | 肌球蛋白抽提溶液 |
| 儀器、耗材 | 玻璃器皿 |
| 實驗步驟 | 1. 準備下面的貯存液（都冷卻到 4℃）。 肌球蛋白抽提溶液：0.5 mol/L KCl，0.1 mol/L K2HPO4 幾升冷的用玻璃器皿蒸餾過的水（dH2O） 4 mol/L KCl 0.5 mol/L KCI 0.5 mol/L CH3COOH 0.5 moI/L K+EDTA，pH 7.0 1 mol/L NaHCO3 用 10 mmol/L K+EDTA 飽和（NH4）2SO4 1 L dH2O 中加 780 g Schwartz-Mann 的超純（NH4）2SO4，然后邊加熱邊攪拌直到溶解。 估計一下體積，加入 0.5 mol/L K+EDTA 使終濃度為 10 mmol/L。用 NH4Cl 調 pH 使表觀值為 8.2。少量樣品用 dH2O 以 1:10 稀釋，pH 值應該為 7.0 左右。 破壞肌肉細胞 2. 可接受的方法處死雞或兔或者使用 Pel-Freez 的冷凍肌肉（冷凍材料在通過絞肉機前先融化一部分）。 3. 快速剝掉雞或兔的皮，然后從你希望回收肌動蛋白和肌球蛋白的部位解剖下來 300 克合適的肌肉，然后把它們放在冰上。 4. 冷的肌肉用一個事先經過冰冷的 10 mmol/L K+EDTA，pH 7.0 浸泡至 4℃ 的絞肉機絞兩次并稱重。 抽提肌動蛋白和肌球蛋白 5. 3 倍體積的肌球蛋白抽提溶液（w/v）在冰庫攪拌抽提，正好 10 分鐘。 6. 混和物分到 6 個 150 ml 離心瓶中，用 GSA 轉頭以最髙速（13000 r/min，17310 g）離心 15 分鐘使不溶的肌肉殘渣沉淀下來。 分離肌球蛋白 7. 轉移上清，測量上清的體積，用 0.5 mol/L 乙酸調 pH 到 6.6。 8. 在輕輕攪拌的同時，慢慢地用 10 倍體積冷的 dH2O 稀釋來沉淀肌球蛋白以及一些抽提到的肌動蛋白。再次檢査 pH 值，如果需要就調節 pH 到 6.6。 9. 用大容量離心機，例如帶 0.5 L 瓶的 GS3 型，以最高速（9000 r/min，8622 g）離心 20 分鐘離下沉淀物。棄掉清亮的上清，留下白色致密的沉淀物。 肌球蛋白的酸沉淀 10. 在 50 mI 2 mol/L KCl 中溶解沉淀物。用一個帶松的研杵的 Dounce 牌勻漿器（一種用玻璃研杵的玻璃勻漿器）以保證徹底破壞沉淀塊。 11. 測量溶液總體積并假設沉淀物的 KCI 濃度為 45 mmol/L 來計算 KCl 的濃度。用 4 mol/L KCl 調節 KCl 濃度到 0.5 mol/L，然后加足量的 0.5 mol/L KCl 來降低黏滯度使足以進行下面的操作。溶液轉移到帶刻度的 1 L 塑料燒杯中。 12. 檢査溶液的 pH 值，如果必要就用 NaHCO3 調 pH 值至 6.7~6.8。 13. 不停地攪拌，緩慢加入冷的蒸餾水來降低 KCl 的濃度直至 0.4 mol/L。 14. 離心（高速 SS-34 型，20000 r/min，32180 g；或者 GSA 型，13000 r/min，17130 g）10 分鐘，把所有沉淀物都離心下來。保留上清。 15. 加冷的 dH2O 以進一步降低 KCl 的濃度至 0.3 mol/L。如前進行沉淀；保留上清和沉淀物。 16. 測量上清的體積并在不停攪拌的情況下用冷的蒸餾水小心地稀釋直至 KCl 濃度為 0.04 mol/L。 17. 離心沉淀肌球蛋白粗絲（高速 SS-34 型或 GSA 型離心 10 分鐘）并棄掉上清。 18. 估計沉淀物的體積，然后加足夠的 4 mol/L KCl 來提高 KCl 的濃度到 0.5 mol/L，然后用 0.5 mol/L KCl 稀釋樣品到 450 ml。 用（NH4）2SO4 沉淀肌球蛋白 19. 緩慢加入飽和的（NH4）2SO4 （向下）使（NH4）2SO4 飽和度為 40%，不停攪拌使充分混合。 20. 離心沉淀（高速 GSA 型 17310 g 離心 15 分鐘），保留沉淀作為 “40% （NH4）2SO4 時的樣品”。 21. 不停攪拌的情況下在上清中加入足夠體積的飽和（NH4）2SO4 使其飽和度為 50%，加入的（NH4）2SO4 體積會是肌球蛋白溶液體積的 1/5。攪拌 15 分鐘。 22. 離心沉淀（見步驟 20 ) 并棄掉上清。標記上“50% （NH4）2SO4 時的樣品”。 23. 為了使蛋白濃度保持最大，在最小體積的 0.5 mol/L KCl 中重懸 40% 和 50% 的 （NH4）2SO4 沉淀物（用刮刀直接把固態的（NH4）2SO4 沉淀放進透析袋）。 24. 在 1 L 0.5 mol/L KCl，10 mmol/L 咪唑-HCl，pH 7.0，10 mmol/L K+EDTA，pH 7.0 中對（NH4）2SO4 沉淀的樣品進行透析，在 24 小時內至少換 2 次透析液。 25. 20000 r/min（31180 g）離心 30 分鐘使溶液變清。這些肌球蛋白在 KCl-EDTA 中可以穩定數周。為了保存更長時間，它可以和甘油以 1:1 混合并貯存在 -20℃。此外，可以讓肌球蛋白留在（NH4）2SO4 中，蓋要的時候透析一小部分。 26. 測定肌球蛋白制品的蛋白濃度，ATP 酶活性，通過 SDS-PAGE 測定純度，和/或通過體外移動試驗測定其功能。 |
記者從中國科學院長春應用化學研究所了解到，該所綠色分離化學與清潔冶金課題組在廢舊動力鋰電池分離回收新工藝上取得新突破。課題組負責人陳繼介紹，我國動力鋰電池生產、使用和出口均居世界前列。鋰電回收和循環利......
介紹在抗體藥物純化工藝中，通常采用經典的三步或兩步層析法，蛋白A（ProteinA）親和介質（填料）因其配基上有多個區域對抗體Fc片段具有特異性吸附能力，因此廣泛用于抗體捕獲步驟（第一步層析）。通過一......
藥物的分離純化是從合成或天然來源中獲得的藥物混合物中，將目標化合物純化為高純度的過程。這是藥物研發和制造過程中非常重要的步驟，因為高純度的藥物確保了其安全性和有效性。藥物的分離純化通常涉及以下一般步驟......
“玩了一輩子沙子”，這是艾捷博雅生物集團董事長汪群杰對自己的描述。從研究生、博士到博士后，汪群杰一直在做有機硅材料，入職安捷倫后開始接觸色譜分離材料，在以硅材料為核心的分離材料上有深厚的沉淀。從安捷倫......
近日，中國科學院上海有機化學研究所質譜引導的SFC/UFPLC切換高通量自動純化系統采購項目公開招標。項目編號：OITC-G220300352項目名稱：中國科學院上海有機化學研究所質譜引導的SFC/U......
融膠液，可以使瓊脂糖凝膠完全融化。同時采用了一種新型的離子交換柱，在特定條件下，使DNA能在離心過柱的瞬間，結合到DNA純化柱上，在一定條件下又能將DNA充分洗脫，從而實現DNA的快速純化。1.低熔點......
PCR產物的直接純化：一、原理PCR產物一般都含有過量的引物、TaqDNA酶及dNTP，這些成分的存在將直接影響到后續的酶切、雙脫氧PCR測序反應等過程,因此有必要除去。目前核酸純化的方法有很多,商用......
在艾滋病毒感染靜息CD4T淋巴細胞的過程中，病毒跨越皮質肌動蛋白柵欄結構是一個關鍵步驟，但其具體機制仍有待研究。最近，中國科學院武漢病毒研究所研究員崔宗強團隊實時動態觀察到單個艾滋病毒入侵和跨越皮質肌......
蛋白質的分離純化在生物化學研究應用中使用廣泛，要利用不同蛋白間內在的相似性與差異，利用各種蛋白間的相似性來除去非蛋白物質的污染，而利用各蛋白質的差異將目的蛋白從其他蛋白中純化出來。圖片來源于網絡根據蛋......
分析測試百科網訊2019年4月3日，艾杰爾-飛諾美第1000臺CHEETAH交付儀式在寧波康龍化成舉辦。本次交付的第1000臺純化儀器是CHEETAHII快速中壓純化色譜，是歷經十年頗受好評的CHEE......