Southern雜交操作步驟及注意事項

Southern 雜交是分子生物學的經典實驗方法。其基本原理是將待檢測的DNA樣品固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號。通過Southern雜交可以判斷被檢測的DNA樣品中是否有與探針同源的片段以及該片段的長度。該項技術廣泛被應用在遺傳病檢測、DNA指紋分析和PCR產物判斷等研究中。但由于該技術的操作比較煩瑣、費時，所以現在有一些其他的方法可以代替Southern 雜交。但該技術也有它的獨特之處，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多態性(RFLP)的檢測等。

一、基因組DNA的限制酶切

根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30μg的DNA。購買的限制性內切酶都附有相對應的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。由于內切酶是保存在50%甘油內的，而酶只有在甘油濃度<5%的條件下才能發揮正常作用，所以加入反應體系的酶體積不能超過1/10。

具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA（1μg /μl）              20   μg
  10×酶切buffer                4.0 μl
  限制性內切酶（10U/μl）        5.0 μl
  加ddH2O                    至 500  μl

在最適溫度下消化1-3hr。消化結束時可取5μl電泳檢測消化效果。如果消化效果不好，可以延長消化時間，但超過6hr已沒有必要。或者放大反應體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解（參見DNA提取方法，但離心轉速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丟失）。

如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。

二、基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb），實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

1. 制備0.8%凝膠：一般用于Southern雜交的電泳膠取0.8%。

2.  電泳：電泳樣品中加入6×Loading 緩沖液，混勻后上樣，留一或兩泳道加DNA Marker。1-2V/cm，DNA從負極泳向正極。電泳至溴酚藍指示劑接近凝膠另一端時，停止電泳。取出凝膠，紫外燈下觀察電泳效果。在膠的一邊放置一把刻度尺，拍攝照片。正常電泳圖譜呈現一連續的涂抹帶，照片攝入刻度尺是為了以后判斷信號帶的位置，以確定被雜交的DNA長度。

三、DNA從瓊脂糖凝膠轉移到固相支持物

轉移就是將瓊脂糖凝膠中的DNA 轉移到硝酸纖維膜（NC膜）或尼龍膜上，形成固相DNA。轉移的目的是使固相DNA與液相的探針進行雜交。常用的轉移方法有鹽橋法、真空法和電轉移法。這里介紹經典的鹽橋法（又稱為毛細管法）。

1. 試劑準備

① 變性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。
  ② 中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;
  ③ 轉移液（20×SSC）： NaCl 175.3g；檸檬酸三鈉82.2g，NaOH 調pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。

2. 操作步驟

① 堿變性:室溫下將凝膠浸入數倍體積的變性液中30min。
  ② 中和:將凝膠轉移到中和液15min。
  ③ 轉移  按凝膠的大小剪裁NC膜或尼龍膜并剪去一角作為標記，水浸濕后，浸入轉移液中5min。剪一張比膜稍寬的長條Whatman 3mm濾紙作為鹽橋，再按凝膠的尺寸剪3-5張濾紙和大量的紙巾備用。按下圖所示進行轉移。（ 轉移過程一般需要8-24hr，每隔數hr換掉已經濕掉的紙巾。轉移液用20×SSC。注意在膜與膠之間不能有氣泡。整個操作過程中要防止膜上沾染其他污物。）
  ④ 轉移結束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液數min，洗去膜上沾染的凝膠顆粒，置于兩張濾紙之間，80°C烘2hr，然后將NC膜夾在兩層濾紙間，保存于干燥處。

四、探針標記

進行Southern 雜交的探針一般用放射性物質標記或用地高辛標記。放射性標記靈敏度高，效果好；地高辛標記沒有半衰期，安全性好。這里介紹放射性標記。

探針的標記方法有隨機引物法、切口平移法和末端標記法，有一些試劑盒可供選擇，操作也很簡單。

以下為Promega公司隨機引物試劑盒提供的標記步驟：

1. 取25-50ng模板DNA于0.5ml離心管中，100℃變性5min，立即置冰浴。

2. 在另一個0.5ml離心管中加入：

Labeling 5×buffer   （含有隨機引物）            10μl
  dNTPmix  (含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)                         2μl
  BSA（小牛血清白蛋白）              2μl
  [a-32P]dATP                       3μl
  Klenow酶                          5U

3. 將變性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混勻。室溫或37℃ 1hr。

4. 加50μl 終止緩沖液終止反應。

標記后的探針可以直接使用或過柱純化后使用。由于a-32P的半衰期只有14天，所以標記好的探針應盡快使用。探針的比活性最好大于109計數/分/μl