毛細管電泳色譜儀與質譜儀的聯用技術

毛細管電泳色譜儀（CE）是以毛細管為分離通道，以高壓直流電場為驅動力，利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數差異進行分離，具有、分辨率高、重復性好、速度快和易于自動化等優點。質譜儀（MS）是通過對樣品離子的質量和強度的測定進行定量和結構分析，具有靈敏度高和速度快等優點。CE與MS聯用綜合了兩者的優點，是分析生物大分子的有力工具。

一、儀器結構：

在CE－MS聯用中，毛細管區帶電泳zui為常用，其它如毛細管凝膠電泳、毛細管膠束電動色譜、毛細管等電聚焦電泳和毛細管等速電泳等應用較少。電子噴霧離子化（ESI）可用于檢測多種高質量的帶電分子，從CE分離出來的分子經過接口可直接進入MS，是MS的離子源。

二、接口技術：

CE－ESI－MS接口的目標是獲得穩定的霧流和的離子化，是影響整個檢測的關鍵因素之一。由于CE需要較高離子強度和揮發性低的緩沖液，而ESI需要較低鹽濃度才能獲得好的霧化和離子化。因此，接口技術必須優化，以盡可能提供好的電子接觸，盡量減少對CE分離效率的影響。此外，每一種接口應選擇相應的緩沖液。CE－ESI－MS接口有同軸液體鞘流接口、無鞘接口和液體連接接口三種類型。

 1、同軸液體鞘流接口：

 同軸液體鞘流接口是連接CE與ESI－MSzui常見的接口。

（1）結構：

在CE毛細管末端外套一個同心不銹鋼毛細管套，內充鞘液。在此不銹鋼套外再套一個同心不銹鋼套，內通鞘氣。鞘液和CE緩沖液在毛細管的混合，同時被鞘氣霧化。鞘液流量通常為每分鐘數納升至數微升，顯著高于CE的流速。由于鞘液的稀釋作用，使霧流穩定性得到改善。理想的鞘液緩沖液的鹽濃度應在高分離（高鹽濃度）和高霧化（低鹽濃度）之間進行優化。由于鞘液在霧化過程中完全蒸發，鞘液的稀釋作用并不顯著降低檢測靈敏度，但混合液體的體積應盡可能小，以避免譜帶展寬。

（2）特點：

由于鞘液對CE流出物的稀釋作用而降低檢測靈敏度，鞘液的成分和濃度對CE分離均有影響。

  2、無鞘接口：

（1）結構：

 將CE毛細管末端做成尖細狀，以獲得穩定的電子霧化。

在CE毛細管末端外套一個同心毛細管套，內通鞘氣。此接口的難點是不易同時保持CE和ESI的電路循環，為此，在毛細管末端粘上金絲或鍍一層金，但金的粘著力差，易被機械的和電子的原因除去。

（2）特點：

接口性能差且壽命短。

3、液體連接接口：

（1）結構：

將CE毛細管末端與一個直徑為10～20μm的槽垂直相連，槽內充有CE緩沖液。與毛細管末端相對的槽的另一端接上ESI。

（2）特點：

可通過任意調節槽內液體流速以改善ESI效果，而這通常是以譜帶展寬和分離效能降低為代價取得的。

此接口技術難度較大，現僅用于芯片CE與MS聯用中。

三、樣品預濃縮方法：

由于CE受進樣量的限制，對一些含量較低的樣品的檢測靈敏度仍顯不足。因此，在樣品分離前應進行預濃縮。

樣品預濃縮方法有基于電泳原理的預濃縮和基于色譜原理的預濃縮。

1、基于電泳原理的預濃縮：

（1）堆積進樣：

1）原理：

根據樣品塞子與CE緩沖液的導電性差異來實現。若樣品的導電性小于CE緩沖液，樣品塞子上的電場強度高于緩沖液，樣品塞子中離子的遷移速度大于緩沖液。若樣品以夾心餅干方式進行CE電泳，則樣品在緩沖液中聚焦濃縮。

2）特點：

可顯著增加樣品的輸出信號，約達20倍。

（2）場放大進樣：

1）原理：

場放大進樣又稱電場聚焦進樣，類似于樣品堆積進樣，也是根據樣品與CE緩沖液的遷移速度差異來實現，差別是進樣步驟和聚焦過程。場放大進樣是在整個進樣過程都施加電壓，聚焦發生在用緩沖液瓶更換為樣品瓶直到CE電泳開始的一段時間。即場放大進樣是根據樣品的遷移速度與電場強度成正比的特點，在CE電泳初期，使樣品從高電場突然轉入低電場，因減速而堆積在電場交界處，使區帶變窄，濃度提高，而達到聚焦濃縮的目的。

2）特點：

可突破樣品堆積進樣70%毛細管體積的進樣量限制，使樣品濃縮約100倍，但有進樣歧視現象。

（3）等速電泳進樣：

等速電泳進樣既是CE的一種電泳模式，又可作為預濃縮的一種方法。采用等速電泳進樣進行樣品預濃縮有耦合毛細管等速進樣和瞬時毛細管等速進樣兩種模式。

1）耦合毛細管等速進樣：

①原理：將兩根毛細管相連接，一根用作等速電泳（ITP），另一根用作CE電泳。

②特點：僅適用于水溶性樣品且裝置復雜，不常用。

2）瞬時毛細管等速進樣：

①原理：用一根毛細管既作ITP電泳，又作CE電泳。

*步，將樣品溶解在前導電解質（通常是氨溶液）中，以壓力進樣方式將樣品導入CE毛細管中。然后將毛細管插入尾隨電解質瓶（通常為醋酸）中，在毛細管兩端施加約30kV電壓，使前導電解質、樣品和尾隨電解質向陰極移動，由于淌度差異，樣品被聚焦在前導電解質和和尾隨電解質之間。

第二步，用前導電解質作為背景電解質進行CE電泳。

 ②特點：對蛋白質和多肽均可進行分析，發展前景。

 2、基于色譜原理的預濃縮：

（1）固相萃取：

1）原理：

固相萃取常用C₂、C₈和C₁₈作吸附劑，萃取床連接在轉移毛細管和CE之間。樣品通過轉移毛細管進入萃取床，用電泳緩沖液沖洗樣品，隨后注入50～100nL有機修飾劑塞子使樣品洗脫進入CE。有機修飾劑可引起樣品堆積。

2）特點：

可顯著降低檢測下限，但會使分離度降低，譜帶展寬，峰拖尾。

（2）液液分配色譜：

1）根據液液分配色譜和電泳進行濃縮：

 ①步驟：

*步，將樣品溶解在非極性溶劑（如乙酸乙酯）中，以電動進樣方式將樣品導入CE毛細管中。同時，由于液體對流作用，可避免大量乙酸乙酯進入毛細管中。

第二步，將毛細管插入尾隨電解質瓶中，在電場作用下開始聚焦。

第三步，達到穩態后，將毛細管插入前導電解質瓶中進行CE電泳。

 ②特點：

此法濃縮能力高達1000倍，但蛋白質易變性，在非極性相中易沉淀。

2）用一張浸有非極性溶劑（如十一碳烷）的聚丙烯膜將預濃縮室隔成兩個部分：一部分是供相，作為樣品進入相；另一部分是受相，作為富集相。兩相均為水溶性。通過調節兩相pH，使樣品在供相中不帶電荷，進入受相則帶電荷，從而達到濃縮目的。

（3）中空纖維液相微萃取：

1）原理：

利用中空纖維壁能選擇性阻止一定分子量的物質通過的特性而達到濃縮目的。

將中空纖維通過Teflon管與CE毛細管相連接，以電動方式進樣，由于蛋白質不能透過中空纖維壁而聚集在毛細管入口端。濃縮完成后，關閉進樣電場，接通分離電場進行CE電泳。

2）特點：

 此法速度快，濃縮效率高，可除掉一些小分子物質（如鹽類），對痕量蛋白質的檢測十分有效。

（4）親和色譜：

1）原理：

將親和色譜柱與CE毛細管相連接，以壓力方式進樣，然后根據樣品性質，以小體積的有機溶劑或特殊緩沖液進行洗脫，進入CE。

2）特點：

此法進樣量可達50μL，濃縮高達100～500倍，可有效地降低檢測下限。

CE－MS聯用大大拓寬了CE和MS的應用領域，但CE固有的缺陷并未克服。在DNA分離時，極高的電場強度容易使較長的DNA發生伸展改變呈棒狀，而降低分離效果。現有的接口類型都有不同程度的缺陷，隨著接口技術的不斷改進、芯片CE與MS聯用技術的完善和新濃縮技術（如分子印跡）的應用，CE－MS在蛋白質組學、化學藥物研究和臨床實驗診斷等領域已顯示了廣闊的前景，正成為分析工作者的重要工具之一。