分析毒性植物毒素

  植物類蔬菜食品和飼料中可能自然含有毒物質吡咯里西啶生物堿(簡稱：PA);因此，專家建議在加工之前首先要檢查其農用原材料及食品、飼料中PA的污染情況，而檢查PA污染情況的方法首先可以是固相萃取(SPE)，然后，進行液相色譜-質譜聯用(LC-MS)的檢測分析。

　　在綠油油的牧場和田野中生長的不僅是健康的綠色，而且也有農戶和牧馬人的眼中釘、肉中刺——有毒的野生草本植物。不僅單指著名的豚草，同樣包含俗稱千里光的草本植物，類似于在歐洲分布很廣的芝麻菜。

　　然而，與芝麻菜相比，豚草、千里光并不健康。豚草及其親緣物種中含有吡咯里西啶生物堿PA，這是植物自身產生的、用于抵御掠食者的“武器”。

　　吡咯里西啶生物堿是一種天然毒素，已被證明具有損傷肝臟的副作用，有些還具有一定的遺傳毒性與致癌作用;即便只誤食了少量的吡咯里西啶生物堿也可以在牛馬中觀察到中毒現象;吡咯里西啶生物堿中毒可以導致嚴重的后果，包括：動物死亡。

   美麗的外表往往具有欺騙性——草本千里光含有吡咯里西啶生物堿毒性物質，其下游產品具有損害肝臟的作用；該種毒物能夠經食品和飼料等食物鏈進入人體內

　　污染檢測

　　不難想象：商業領域中類似茶一類的飲品中，在茴香茶、洋甘菊花茶、草藥茶、薄荷茶和檸檬香蜂草茶以及某些蜂蜜中都有可能含有吡咯里西啶生物堿，令人擔憂。柏林聯邦分析評估研究所BfR的分析評估報告得出的結論是：長期(慢性)攝入含有PA成分的食物(花草茶、路易波士茶、紅茶和綠茶以及蜂蜜)，不僅對兒童，而且對成年人都有健康風險。聯邦分析評估研究所BfR聲稱：食品生產廠家需要采取積極的措施減少食品中的吡咯里西啶生物堿的含量。

　　所遇到的挑戰到底有多大?數據顯示：自身能夠產生吡咯里西啶生物堿的植物總數共計6000多種，占全球開花植物種類的3%，食品法和食品科學聯合會的Birgit Christall博士表示：“聯邦分析評估研究所BfR報道，在全球350多種植物中共檢測出600多種不同的吡咯里西啶生物堿化合物及其N-氧化物。

　　Birgit Christall博士在近期2015年12月(第16屆BfR消費者保護論壇)上發表的演講中指出：沒有采取百分之百、畜吡咯里西啶生物堿保護措施。

　　該實際情況表明：與藥品不同，在目前的食品和飼料領域中并沒有吡咯里西啶生物堿含量與限量的法律規定;“國際食品法典委員會”同樣沒有關于吡咯里西啶生物堿處理與釋放量建議與“操作規范”。歐洲食品安全局EFSA目前也沒有規定吡咯里西啶生物堿的每日耐受攝入量TDI值，而BfR評估分析研究所制定的零容忍極限值似乎并不現實。Birgit Christall博士表示：“真正有意義的是將食品和飼料中的吡咯里西啶生物堿含量保持在盡可能低的水平上，但是，相關的檢測樣本和有效樣本數量，需要以高靈敏度和高效檢測分析技術為前提。

圖2 測定吡咯里西啶生物堿時使用的是一套“組合檢測儀”：自動化固相萃取SPE采用的一臺多用途采樣器（Derstel公司的MPS型）與Agilent技術公司研發生產的LC-MS/MS高效液相色譜-質譜微量元素分析系統（1290 HPLC + 6495三重四極桿質譜儀）

　　有效的消費者保護措施

　　包括：飼料和食品在內的農產品吡咯里西啶生物堿檢測分析遠比BfR風險評估研究所發表的一份主題聲明復雜的多。BfR風險評估研究所在該份主題聲明中指出：由于吡咯里西啶生物堿具有多種不同的異構形式并在多種不同的食品中出現過，對其進行檢測分析是一項非常艱巨且具有挑戰性的任務。

　　近年來，BfR風險評估研究所開發出吡咯里西啶生物堿具體的檢測分析和試驗驗證方法。這些方法可以在國家和工業企業食品、飼料生產和監控中使用，然而，目前只有有限的吡咯里西啶生物堿可以作為參考標準使用;意味著：BfR風險評估研究所需要開發更多的檢測分析方法，以便能夠對所有的吡咯里西啶生物堿類別進行檢測分析。

　　BfR風險評估研究所推薦的吡咯里西啶生物堿檢測分析方法是：首先，需要用固相萃取技術SPE對植物材料中的吡咯里西啶生物堿進行富集，然后，用高效液相色譜-質譜(LC-MS/MS)微量元素分析法進行檢測分析并在硫酸水的超聲波浴池中對植物材料進行兩次吡咯里西啶生物堿萃取并用離心機對萃取到的樣本液進行離心分離、等分上清液并加入C-18試劑進行固相萃取。在利用甲醇洗脫吡咯里西啶生物堿后，將洗脫液全部蒸發掉，將剩余殘留物溶解于甲醇-水混合液(HPLC高效液相色譜法初始條件)中，接下來，進行色譜分離與質譜檢測。

　　專門從事食品和飼料檢測分析的專業實驗室領導人、食品技術專家Franziska Chmelka女士表示：“BfR風險分析研究所推薦方法的最大缺點是：工作量大、檢測分析時間長，尤其是：樣本制備時間過長。”為了提高檢測分析的效率，她領導Tela實驗室對BfR方法進行了自動化控制。

　　所使用的檢測分析技術

　　Franziska Chmelka女士及其同事們運用的是一套“組合式檢測儀”：自動化固相萃取SPE運用多用途采樣器(Derstel公司的MPS型)、Agilent技術公司研發生產的高效液相色譜-質譜(LC-MS/MS)、微量元素分析系統(1290?HPLC+6495三重四極桿質譜儀)。

　　檢測分析樣本分離是在標準的反相高效液相色譜狀態下進行(Nucleodur公司，C18，HTec：250×2?mm×5?μm，MN色譜柱)，運用5mM甲酸(洗脫液A)和甲醇(洗脫液B)時的洗脫梯度為：0分鐘(5%B)-3分鐘(5%B)-7分鐘(20%B)-13分鐘(20%B)-16分鐘(65%B)-17分鐘(95%B)-20.1分鐘(5%B);流速為0.25?mL/min，色譜柱柱溫為28攝氏度，注入洗脫液為5?μL;利用(MRM多反應監測設備，ESI positive型)的多反應監測模式對分析物進行檢測分析。

　　在方法開發過程中，使用的是BfR方法中提供的17種不同吡咯里西啶生物堿標準水溶液：單豬屎豆堿、芝麻菜葉千里光堿、中間素、豚草、石松胺、野百合堿的N-氧化物、芝麻菜葉千里光堿N-氧化物，中間素N-氧化物，光萼野百合堿，豚草-N-氧化物，春生千里光堿，千里光堿，光萼野百合堿N-氧化物，春生千里光堿N-氧化物，千里光堿N-氧化物，毛果天芥菜堿和毛果天芥菜堿的N-氧化物。

圖3 吡咯里西啶生物堿的標準混合物檢測分析獲得了具有良好分辨率信號的干凈色譜圖：在圖示情況下需要進行良好的分離，因為，許多物質的準備過程非常相似

　　重點是SPE固相萃取

　　Franziska Chmelka女士表示：“該方法研發的重點聚焦于時間長、工作量大的檢測分析步驟，也就是SPE固相萃取。”

　　經過一段時間的試驗后，Tela公司專家們尋找到了最合適的吸附劑試劑材料C-18(MN色譜柱，C18ec，3毫升/500毫克)。在該方法基礎上，SPE固相萃取的所有步驟均能夠實現自動化：用5?mL甲醇和5?mL水吸附劑調配、在5?mL樣本中加注吸附劑以及運用5?mL甲醇洗脫分析物等。

　　醫學博士、企業管理合伙人和LC-MS技術專家Norbert Helle先生同樣宣布了他的成功之處：“洗脫液蒸發自動化;用1?mL，10%甲醇恢復殘留物并向高效液相色譜-質譜微量(LC-MS-MS)元素分析系統中注入5?μL提取物。”?

　　檢測分析標準混合液能夠獲得非常清晰的色譜圖并具有非常好的分辨率;Franziska Chmelka女士表示：“單一物質的良好分離和溶解非常重要;許多物質的轉換過程非常相似，各種不同吡咯里西啶生物堿的區分只能通過保留時間判斷。”

　　最后，Tela公司的應用技術專家通過真實的千里光葉子樣本檢測分析方法展示出該技術方法、設備的實際性能。實驗分析結果表明：“所有的統計學相關參數、數據表明：自動化SPE固相萃取相較于質譜-色譜(LC-MS)技術具有良好的檢測分析質量。”

　　“在低至1?ng/mL的寬校準范圍內具有良好的線性度，在重復精度方面同樣具有良好的表現：分析物的回收率在85%至98%之間;該技術方法的重復再現性，包括：樣本制備和測量在內的重復再現性變化范圍在1.29%至4.83%之間。

　　Franziska Chmelka女士表示：“最重要的是：在幾天的檢測試驗期內保留時間非常短，在整個檢測時間內只有0.063%至0.35%的波動;可以探測的檢測范圍在0.5-0.05μg/kg之間。”