復旦大學從基因組學角度揭示SARSCoV2的起源和出現

　　新型人類冠狀病毒SARS-CoV-2（之前稱為2019-nCoV）的持續大流行引起了全球的極大關注。我們和中國的其他人參與了對這種病毒的初始基因組測序。在本文中，我們描述了針對SARS-CoV-2的出現，這些基因組數據揭示了什么，并討論了我們對其起源理解上所存在的差距。

　　一種新的人類冠狀病毒

　　2019年12月下旬在中國湖北省武漢市出現了首批關于新型肺炎（COVID-19）病例的報告，不過回顧性分析已確認一名患者早在2019年12月1日就出現了癥狀。鑒于SARS-CoV-2病例的數量正在快速增長并在全球范圍內蔓延，我們將避免引用已確診的感染病例數。然而，實際病例數可能會大大超過報告的病例數，這是因為非常輕微或無癥狀的感染常被排除在計數之外。任何病例數少報的情況顯然意味著，在疫情最嚴重的地區，與COVID-19相關的病死率（case fatality rate, CFR）將低于目前引用的數字。病死率還將在地理上、年齡組之間和時間上有所不同。盡管沒有大規模的血清學調查可能無法解決這些不確定性，但是從當前數據來看，很明顯，COVID-19的病死率顯著高于季節性流感，但低于最近在人類中出現的兩種密切相關的冠狀病毒---導致2002/2003年嚴重急性呼吸道綜合征（SARS）疫情爆發的SARS-CoV；MERS-CoV，自2015年以來，它一直是中東呼吸綜合征（MERS）疫情主要集中在阿拉伯半島爆發的主要原因---的病死率。但是，也很明顯，SARS-CoV-2的傳染性比SARS-CoV和MERS-CoV都高，而且患者可在無癥狀時或有癥狀前傳播這種病毒，但傳播的頻率仍不確定。

圖片來自Eye, 2020, doi:10.1038/s41433-020-0790-7。

　　考慮到SARS-CoV-2無疑有一個人畜共患病的起源，它與一家海鮮市場之間存在的關聯性應當是不足為奇的。然而，鑒于并非所有早期病例都與這家海鮮市場相關，因此SARS-CoV-2出現的故事可能比最初想象的更為復雜。如今從這家海鮮市場上獲得了“環境樣本”（可能是物體表面）的基因組序列，而且針對它們的系統進化樹分析顯示它們與從最早的武漢患者中采樣的病毒密切相關。盡管這再次表明這家海鮮市場在病毒出現中發揮了重要作用，但尚不清楚這些樣本是否來自無意中獲得了傳染性物質的人還是源自這個地方的動物或動物殘留物。不幸的是，這家海鮮市場上明顯缺乏直接的動物采樣，這可能意味著，很難甚至不可能準確地識別出這個地方的任何動物宿主。

　　在臨床病例開始出現之后，我們的研究團隊以及其他一些團隊嘗試確定這種致病病原體的基因組序列。我們著重關注是一名在癥狀發作六天后于2019年12月26日在武漢市中心醫院住院的患者。這名患者正出現發燒、胸悶、咳嗽、疼痛和無力，以及指示肺炎的肺部異常，其中這些肺部異常似乎在COVID-19中很常見。幸運的是，下一代宏轉錄組測序使得我們能夠在2020年1月5日從這名患者體內獲得完整的病毒基因組。初步分析顯示這種病毒與SARS樣冠狀病毒（冠狀病毒科）密切相關。

　　這一結果立即報告給有關部門，并在同一天將這個基因組序列（Wuhan-Hu-1毒株）的注釋版本提交給NCBI/GenBank。盡管GenBank序列（登錄號MN908947）是SARS-CoV-2的第一個可用序列，但隨后對它進行了校正以確保其準確性。

　　在英國愛丁堡大學Andrew Rambaut博士的幫助下，我們于2020年1月11日（格林威治標準時間, GMT）早些時候在開放存取的virological.org網站（http://virological.org/）上發布了這種病毒的基因組序列。不久之后，中國疾控中心在公眾可訪問的GISAID數據庫（https://www.gisaid.org/）上類似地發布了SARS-CoV-2基因組序列（以及相關的流行病學數據）。在撰寫本文時，已有近200個SARS-CoV-2基因組可公開獲得，這代表了來自中國及其他地區的這種病毒的基因組多樣性，并提供了可自由獲取的全球資源。重要的是，SARS-CoV-2基因組序列數據的發布促進了診斷測試和感染性克隆（infectious clone）的快速開發。研發有效疫苗和抗病毒藥物的競賽正在進行中，而且針對抗病毒藥物的臨床試驗正在逐步展開。

　　比較SARS-CoV-2和其他的冠狀病毒

　　這些最早的基因組序列數據清楚地表明SARS-CoV-2是乙型冠狀病毒屬（Betacoronavirus，有時也譯為β冠狀病毒屬）的成員，屬于一個包括SARS-CoV在內的Sarbecovirus亞屬（MERS-CoV屬于一個單獨的亞屬：Merbecovirus）。確實，初步比較顯示SARS-CoV-2在核苷酸水平上與SARS-CoV的相似度約為79%。當然，在不同基因上的相似性模式差異很大：SARS-CoV和SARS-CoV-2在刺突蛋白（S）基因上僅顯示約72％的核苷酸序列相似性，其中S蛋白是一種與宿主細胞受體相互作用的關鍵表面糖蛋白。

　　考慮到這些密切的進化關系，SARS-CoV-2的基因組結構類似于其他β冠狀病毒就不足為奇了，它的基因順序為5'-復制酶ORF1ab-S-envelope（E）-membrane（M）-N-3'。SARS-CoV-2的較長復制酶ORF1ab基因長度超過21 kb，包含16個預測的非結構蛋白以及許多在功能上可能與SARS-CoV相類似的下游開放閱讀框（ORF）。2013年從中國云南省采集的中華菊頭蝠中獲得的一種相關病毒極大地促進了比較基因組分析。這種病毒稱為RaTG13，在核苷酸序列水平上與SARS-CoV-2的相似度約為96％。盡管有這種序列相似性，但是SARS-CoV-2和RaTG13在許多關鍵基因組特征上還是不同的，可以說，其中最重要的是SARS-CoV-2在S蛋白的S1亞基和S2亞基交界處含有一個多堿性切割位點（polybasic cleavage site）插入。盡管位于S1/S2切割位點附近的多堿性位點存在于包括HCoV-HKU1在內的其他人類冠狀病毒和高致病性的禽流感病毒毒株中，但是這種可能增加了SARS-CoV-2傳染性的插入并不存在于相關的蝙蝠β冠狀病毒中。此外，SARS-CoV-2和RaTG13的受體結合結構域（RBD）僅有大約85％的相似度，并且在RBD的六個關鍵氨基酸殘基中僅有一個是相同的。重要的是，序列和結構比較都提示著SARS-CoV-2 RBD非常適合與也被SARS-CoV使用的人ACE2受體結合。重要的是，最近在2019年中期從云南省另一種菊頭蝠中取樣的病毒（RmYN02）中觀察到了在S1/S2切割位點上氨基酸PAA的獨立插入，這表明這些插入事件反映了冠狀病毒正在進行的進化的一個自然部分。雖然RmYN02在S蛋白上與SARS CoV-2相對不同（?72％序列相似度），但是在較長的復制酶基因上，它與這種人類冠狀病毒具有最為密切的親緣關系（?97%的核苷酸序列相似度）。

　　盡管SARS-CoV和MERS-CoV與SARS-CoV-2密切相關并且都有蝙蝠宿主，但這兩種病毒之間的生物學差異卻很明顯。如上所述，SARS-CoV-2的傳染性明顯更高，從而導致與SARS-CoV和MERS-CoV完全不同的流行病學動態。在后兩種病毒中，病例數的增長相對較慢，而MERS-CoV從未完全適應人類傳播：大多數病例是由于阿拉伯半島的駱駝溢出造成的，僅零星地發生人與人之間的傳播。相比之下，SARS-CoV-2在當地的顯著傳播最讓人吃驚。確定支撐這種傳播能力的病毒學特征顯然是當務之急。

　　SARS-CoV-2的人畜共患病起源

　　COVID-19的出現和迅速傳播標志著一場完美的流行病風暴。這是一種毒性相對較高的呼吸道病原體，它來自一個具有跨越物種界限的不尋常本領的病毒家族。它出現在一個主要的人口中心和旅游中心，就在一年中最大的旅游旺季---中國春節---前夕。確實，流行病學模型表明SARS-CoV-2在武漢市被嚴格隔離之前已經在中國廣泛傳播也就不足為奇了。

　　早期基因組比較顯示這種與SARS-CoV關系最密切的病毒也來自蝙蝠，這也不足為奇。近年來的采樣已經確定了一系列令人印象深刻的蝙蝠冠狀病毒，包括RaTG13和RmYN02。因此，對于多種冠狀病毒而言，蝙蝠無疑是重要的宿主。盡管如此，蝙蝠在SARS-CoV-2的人畜共患病起源中所起的確切作用尚未確定。特別是，這些與SARS-CoV-2關系最密切的蝙蝠冠狀病毒是從距武漢市1500多公里的云南省的動物中取樣的。湖北省的蝙蝠冠狀病毒相對較少，而且那些已被測序的蝙蝠冠狀病毒在系統進化樹上與SARS-CoV-2距離相對較遠。基于此的一個簡單的推斷是，我們對蝙蝠病毒的采樣強烈偏向某些地理位置。這將需要在以后的研究中加以糾正。此外，盡管96％～97％的序列相似度聽起來像是現有的蝙蝠病毒與SARS-CoV-2密切相關，但是實際上這可能代表20多年的序列進化（然而，如果這種病毒在人類中有很強的適應性進化，那么潛在的分子時鐘可能以不確定的速度滴答作響）。因此，幾乎可以肯定的是，更多的采樣將會鑒定出與SARS-CoV-2親緣關系更近的其他蝙蝠病毒。一個關鍵問題是這些病毒或來自任何其他動物的病毒是否包含這些關鍵的RBD突變以及與SARS-CoV-2中相同的弗林蛋白酶樣切割位點插入。

　　盡管蝙蝠很可能是這種病毒的天然宿主，但它們與人類之間的生態隔離使得其他哺乳動物物種很可能充當“中間”或“擴增”宿主，在這些中間宿主中，SARS-CoV-2能夠獲得在人類中有效傳播所需的部分或全部突變。就SARS-CoV和MERS-CoV而言，果子貍和駱駝分別起著中間宿主的作用，盡管MERS-CoV可能在駱駝體內存在了幾十年，然后才在人類身上出現，但在多次跨物種事件中，這些動物可能被更好地認為是真正的宿主。為了確定這些中間宿主物種可能是什么，必須對來自濕貨市場或居住在人群附近的動物進行更廣泛的采樣。最近在非法進口到中國南部（廣東和廣西）的馬來亞穿山甲中發現了與SARS-CoV-2密切相關的病毒，這突出說明了這一點。廣東穿山甲冠狀病毒在RBD上與SARS-CoV-2特別密切相關，包含認為使得與ACE2受體結合的六個關鍵突變中的全部六個（盡管它們在基因組的剩余部分上與SARS-CoV-2存在更大的差異）。盡管穿山甲因經常被人們非法販運和處于瀕危狀態而引起人們極大的興趣，但是穿山甲攜帶與SARS-CoV-2相關的病毒強烈表明，各種哺乳動物中都存在大量相關的β冠狀病毒但尚未取樣。 雖然我們過去在冠狀病毒中的經驗表明，動物宿主---天然宿主和中間宿主---的進化解釋人類SARS-CoV-2出現的必要條件，但是不能排除這種病毒在2019年12月首次被發現之前在一段‘隱性’傳播時間內在人類中獲得了一些關鍵突變。特別是，這種病毒可能比預期的更早在人群中出現（也許甚至最早并不在武漢出現），但是由于無癥狀感染病例，具有輕度呼吸道癥狀的病例，甚至零星的肺炎病例，它在用于監視和病原體識別的標準系統中并未被觀察到。在這段隱性傳播期間，這種病毒可能逐漸獲得了關鍵突變（可能包括RBD和弗林蛋白酶切割位點插入），從而使得它能夠完全適應人類。直到發生了一系列肺炎病例，我們才能夠通過常規監視系統檢測到COVID-19。顯然，對呼吸道感染的回顧性血清學或宏基因組學研究將有助于確定這種情況是否正確，盡管這樣的早期病毒可能永遠不會被檢測到。

　　另一個受到廣泛關注的問題是SARS-CoV-2是否是一種重組病毒，以及這種重組是否可能促進了它的出現。一個復雜的因素是sarbevirus病毒和更廣泛的冠狀病毒經歷了廣泛的重組，因此區分有助于病毒出現的重組與“背景”重組事件并非易事。重組可見于sarbevirus病毒基因組的多個位置（包括在S蛋白中）以及與SARS-CoV-2密切相關的蝙蝠病毒中。比如，有證據表明SARS-CoV-2、RaTG13和廣東穿山甲冠狀病毒之間會發生重組，而RmYN02的基因組類似地受到重組的影響。但是，很難確定重組事件的確切模式和基因組譜系，尤其是因為許多重組區域可能較小，并且隨著我們對更多與SARS-CoV-2相關的病毒進行采樣，這些重組區域可能會發生變化。為了解決這些問題，再次有必要對動物種群中的病毒多樣性進行更廣泛的采樣。

　　正在進行的SARS-CoV-2基因組進化

　　隨著COVID-19流行病的發展，更多的病毒基因組已被測序。正如基于它們最近的共同祖先所預期的那樣，來自武漢的最早樣本包含相對較少的遺傳多樣性。雖然這可以阻止詳細的系統進化樹和譜系地理學推斷，但是它確實表明武漢的公共衛生部門在檢測第一批肺炎聚集性病例方面做得非常出色。但是，這種看似最近的共同祖先并不排除存在一個在人類中隱性傳播的疫情爆發前時期。

　　盡管積累遺傳多樣性意味著如今有可能檢測到SARS-CoV-2序列的不同系統進化樹簇，但僅通過基因組比較很難確定這種病毒在全球人群中傳播時是否固定了表型上重要的突變，而且任何此類聲明都需要仔細的實驗驗證。考慮到RNA病毒特征性的高突變率，很明顯在這種病毒基因組中將出現更多的突變，這些突變將有助于我們追蹤SARS-CoV-2的傳播。

　　但是，隨著流行病的蔓延，我們的序列樣本量相對于病例總數來說可能非常小，以至于很難（如果不是不可能的話）檢測每個傳播鏈。因此，在嘗試推斷確切的傳播事件時必須格外小心。順便說一句，盡管冠狀病毒的突變率可能比其他RNA病毒低，這是由于3'→5'核糖核酸外切酶內在地具有一定的校對活性，但它們的長期核苷酸替換速率（即分子進化）分布與其他RNA病毒相同。這提示著較低的突變率在一定程度上被宿主內較高的病毒復制速率所補償。盡管沒有證據表明這種突變能力（對RNA病毒常見）會導致表型---比如傳播性和毒力---發生任何根本性變化，這是因為這些變化很少在單個疾病疫情規模上發生變化，但是監視病毒傳播時表型的任何變化顯然很重要。很有可能，COVID-19的病例數和/或病死率的任何下降都可能是由于人群免疫力的提高和流行病學背景而不是這種病毒中的突變變化引起的。

　　結論

　　SARS-CoV-2似乎將不可避免地成為人類中的第五種地方性冠狀病毒（其他四種為HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKU1），并且目前正在完全易感人群中傳播。冠狀病毒顯然具有跨越物種界限并適應新宿主的能力，這使得預測未來會有更多的病毒出現變得很簡單，不過尚不清楚為何相比于一些其他的RNA病毒，冠狀病毒具有這種能力。至關重要的是，對動物冠狀病毒的監視應包括蝙蝠以外的動物，這是因為中間宿主的作用可能非常重要，從而為病毒在人類中的出現提供了更直接的途徑。

　　鑒于野生動物中病毒的多樣性以及它們的持續進化，可以說，降低未來疫情爆發風險的最簡單最具成本效益的方法是盡可能限制我們對動物病原體的接觸。盡管我們與動物世界的親密關系意味著我們無法建立堅不可摧的屏障，但是針對非法野生動物貿易采取更強有力的行動，以及將所有野生哺乳動物（也許還有禽類）從濕貨市場中清除將提供一個重要的緩沖。