基因編輯進展梳理PartICRISPR系統拓展及機制研究（二）

1.  兩篇研究揭示Cas4核酸酶對于CRIPSR免疫反應的重要性

2018年3月27日的，Shiimori團隊在Cell Reports期刊上發文，證明了Cas4核酸酶是間隔序列前體臨近基序( PAMs )靶向選擇所必須的，有助于Cas1和Cas2選擇新的CRISPR間隔物，并賦予天然宿主Synechocystis I- D CRISPR干擾能力[14]。同年，Shiimori團隊于6月7日在Molecular Cell期刊上發表了工作，展示了Cas4在嗜熱古菌P. furiosus中通過DNA序列整合的方式進行CRISPR-Cas免疫反應，并確定了兩種Cas4（Cas4-1和Cas4-2 )在P. furiosus CRISPR間隔區DNA片段的獲取及在原間隔區加工中的關鍵作用。另一方面，Cas4確保CRISPR間隔區在一個特定的方向上整合，最終觸發CRISPR免疫反應[15]。總而言之，這些發現為Cas4核酸酶在CRISPR陣列的關鍵作用，為原間隔區生成和功能間隔區整合提供了體內依據。

圖4. Cas4的作用機制[14-15]

2. 冷凍電鏡技術助力進一步解析CRISPR/Cas系統工作機理

盡管CRISPR系統已被廣泛用于生物醫學到生物技術或合成生物學等各個研究領域，但目前人們對其精細的工作機制仍然缺乏詳細了解。今年三篇突破性的研究通過低溫冷凍電鏡技術分別揭示了不同CRISPR系統的結構以及工作機制，為CRISPR/Cas系統的改進及臨床治療提供了重要的理論基礎。

1) I型CRISPR/Cas系統分子作用機制闡釋：2018年7月6日，來自美國康奈爾大學和哈佛醫學院的研究人員在Science期刊上發文，研究利用單顆粒低溫電鏡技術（cryo-EM）解析TfuCascade/R-loop/Cas3三元復合物在R-loop切割前后的結構，揭示了人們困惑的Cas3招募、DNA切割和降解機制。這些研究為理解I型CRISPR/Cas系統的分子作用機制提供了結構基礎[16]。

2) Cas13d功能結構研究：2018年9月20日，美國Salk研究所的科學家們利用冷凍電鏡解析了Cas13d-sgRNA二元復合物和Cas13d-sgRN-靶點RNA三元復合物的結構及一系列動態過程，這使得我們更詳細地看到Cas13d-系統如何被引導到RNA并切割的過程。這為我們改進CRISPR系統，使其更為有效地為RNA的疾病治療奠定基礎[17]。

3) Cas12d構象循環解析：2018年12月13日，來自諾和諾德基金會中心的研究人員利用一種低溫電鏡技術，闡明了Cas12a靶向DNA切割和隨意降解ssDNA的工作機制，揭示了Cas12a切割其靶DNA，釋放非特異性切割活性，激活后降解ssDNA分子等工作機制。這使得我們可以通過調整CRISPR引擎來達到特定的預期效果[18]。

圖5. 低溫冷凍電鏡技術揭示了CRISPR系統的結構以及工作機制[16-18]

四、基于CRISPR系統的基因編輯研究取得突破性進展

CRISPR/Cas基因編輯系統在人類治療應用方面具有巨大的潛能，充分了解體內編輯系統的修復機制將有助于我們更加高效且準確地進行基因編輯，為安全有效的臨床應用提供充足的理論和技術基礎。

1.  范可尼貧血通路在CRISPR-Cas9編輯形成DSBs修復過程中發揮關鍵作用

2018年8月，美國加州大學伯克利分校的研究人員在Nature Genetics期刊上發表的研究工作，顛覆了之前的“細胞在Cas9酶剪切DNA后修復基因”的假說，研究人員通過CRISPR干擾技術對2000多個基因進行沉默，發現范可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）中的FANCD2蛋白會定位在Cas9誘導的DSBs上，表明它在調節基因組編輯中起著關鍵作用——調節FANCD2蛋白可以提高HDR頻率。同時發現Fanconi貧血途徑同NHEJ無關，而是通過提高同源重組效率使得修復機制轉向單鏈模板修復機制，因而通過調控Fanconi貧血通路的活性可以提高HDR的編輯效率。這一發現將有助于提高在基因組中插入外源DNA的效率，并確保CRISPR編輯獲得預期的結果[19]。

圖6. 范科尼貧血( FA )途徑介導的雙鏈斷裂( DSB )修復[19]

2. 精準且可預測的CRISPR染色體重排揭示Cas9介導的堿基插入規律

2018年7月19日，來自上海交通大學的吳強課題組在Molecular Cell期刊上發表了團隊的最新研究成果，顛覆了現有的基因編輯理論。他們發現Cas9切割DNA產生的切口會產生突出末端，而不僅僅只有之前報道的平口末端的形式，同時利用高通量測序針對成對導向RNA編輯后DNA修復方式進行分析，發現斷裂末端的修復方式是可預測的，呈現出非常有規律的形式。這一顛覆性的發現為優化和改造基因編輯技術奠定了堅實基礎[20]。

圖7. CRISPR系統切割后的修復是精準且可預測的[20]

3. 無模板CRISPR/Cas9基因編輯的精準性被揭示

長期以來，在沒有提供體模板的情況下，CRISPR切割后的修復通常被認為是隨機且異質的。2018年11月7日在Nature期刊上HMax W. Shen團隊發現，通過CRISPR/Cas9靶向基因組的2000多個位點來檢測細胞是如何進行修復的，結果顯示無模板的Cas9基因編輯是可預測的，經編輯的基因并不包含大量的變異，而是一種單一的結果。同時他們通過導入這些大數據，建立了一種機器學習模型（indelphi），它可以高精度地預測五個人類和小鼠細胞系中基因編輯的修復結果，并且將這一預測用于測試人類疾病的修復效果。這種模型能將致病基因型精確修復到預測的基因型，從而能夠準確地校正人類疾病相關的突變。這項研究為精確、無模板的基因組編輯建立了基礎[21]。

隨后，2018年11月27日Felicity Allen團隊在Nature 也發文，他們合成構建了超過4萬多對導向RNA和靶向DNA序列的編輯文庫系統探索CRISPR/Cas9的切割修復機制，明確了修復的結果是取決于靶向區域的DNA序列，大多數可再現的突變是單堿基插入、短的缺失或更長的微同源性介導的缺失的結果。同時也利用大數據開發了一種機器學習算法（FORECasT），能夠實現僅使用靶位點DNA序列來預測糾正的結果[22]。這些機制的深入理解和新工具的開發將有助于人們更好地設計基因編輯實驗。

綜上，為大家簡單介紹了2018年新型CRISPR系統的開發及機制研究方面的重要事件。目前CRISPR-Cas9已經成為一種簡單、精確且快速的基因編輯技術，廣泛應用于醫學及農林牧等諸多生命科學相關領域，如醫學中常涉及眼疾、血液病以及其他遺傳病。同時我們也認識到，這一技術依然存在許多問題以及諸多潛力有待繼續研究和拓展，我們相信在不久的將來CRISPR-Cas9將會在各個領域展現其不可估量的巨大價值。

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