嵌合抗原受體T細胞介紹

　　過繼性細胞免疫治療是目前較為有效的惡性腫瘤的治療方法之一。隨著技術的日趨成熟, 已在多種實體瘤和血液腫瘤的臨床治療中取得較好療效。

　　摘要: 過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy, ACI)是目前較為有效的惡性腫瘤的治療方法之一。隨著技術的日趨成熟, 已在多種實體瘤和血液腫瘤的臨床治療中取得較好療效。其中, 嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)T細胞技術是近年來發展非常迅速的一種細胞治療技術。通過基因改造技術, 效應T細胞的靶向性、殺傷活性和持久性均較常規應用的免疫細胞高, 并可克服腫瘤局部免疫抑制微環境和打破宿主免疫耐受狀態。目前, CAR的信號域已從第一代的單一信號分子發展為包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信號結構域(第二、三代), 臨床應用廣泛。但是, 該技術也存在脫靶效應、插入突變等臨床應用風險。該文將就CAR-T細胞技術在惡性腫瘤免疫治療中的應用及可能存在的問題作一綜述。

　　關鍵詞 嵌合抗原受體； 基因改造； 過繼性免疫細胞治療

　　治療在腫瘤治療中的作用日益受到重視。研究發現, T淋巴細胞是腫瘤細胞的天敵, 在腫瘤免疫應答中起主要作用, 對腫瘤細胞有極強的殺傷作用。但是, 使用內源性T細胞進行腫瘤免疫治療時, 靶抗原需經過加工處理后才能和靶細胞表面的主要組織相容性復合物(main histocompatibility complex, MHC)作用, 也就是存在我們常說的"MHC限制性"。然而, 腫瘤免疫編輯的過程會使MHC在腫瘤細胞表面表達下降, 破壞抗原加工過程, 降低肽段免疫原性。這樣長期形成的免疫逃逸機制, 能使腫瘤細胞成功躲避T細胞攻擊, 腫瘤快速增殖。

　　此外, 人體內腫瘤特異性的T細胞數量較少, 并且由于大多數腫瘤細胞不斷表達自體抗原, 使得靶向這些抗原的T細胞通過免疫耐受機制被中和或移除, 數量進一步減少。所以, 包括細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine-induced killer cell, CIK細胞)在內的T細胞過繼性免疫治療雖然在部分腫瘤的治療中取得了一定的效果, 但在大多數腫瘤中療效尚不能令人滿意。

　　近年來發展的利用基因改造技術表達腫瘤特異性嵌合抗原受體的T細胞治療技術進展迅猛, 在體外和臨床試驗中顯示出良好的靶向性、殺傷活性和持久性, 為過繼性細胞免疫治療提供了新的有效解決方案, 展示了巨大的應用潛力和發展前景[1]。

　　細胞技術在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、腦膠質瘤等惡性腫瘤治療中均顯示出良好的抗腫瘤效應。

　　1.1 第一代CAR-T細胞

　　早在1989年, Eshhar研究小組[3-4]就將免疫球蛋白樣scFv和FcεRI受體(γ鏈)或CD3復合物(ζ鏈)胞內結構域融合形成嵌合受體, 即第一代CARs。表達CAR的T細胞以抗原依賴、非MHC限制的方式結合腫瘤抗原, 啟動并活化特異性殺傷腫瘤反應。CARs表達的穩定性依賴于所用的胞內信號域。盡管最近研究報告顯示, 去除CD3ζ鏈的兩個ITAMs磷酸化作用, 能減少T細胞轉導后的凋亡, 有利于轉基因的長期表達[5-6]。但是, 目前含CD3ζ鏈的CAR-T細胞相對于含FcεRIγ鏈的CAR-T細胞臨床研究更多。原因可能是因為CD3ζ含有三個ITAMs, 而FcεRIγ鏈只有一個ITAM, 雖然體內表達率較低, 但是能更有效激活T細胞, 對腫瘤根除能力更強。此外, CAR-T細胞的跨膜區一般由同源或異源的CD3、CD8或CD28等二聚體膜蛋白組成, 通過CAR二聚化以及與內源性TCR的相互作用產生的信號有助于T細胞的激活。Bridgema等[7]發現, 抗CEA CAR-T細胞能通過自身CD3ζ跨膜區的二聚化作用, 有效激活初始人T淋巴細胞。Kershaw等[8]報道了逆轉錄病毒介導的抗α-葉酸受體CAR修飾的T細胞治療14例卵巢癌患者。輸注2 d后, CAR-T細胞在體內可大量檢測到, 但1個月后迅速下降至難以檢測的水平, 也沒有觀察到對腫瘤的免疫應答反應。Julie等[9]針對細胞黏附分子-L1, 采用CE7R的單鏈抗體與CD3ζ結合, 以質粒DNA作為載體構建第一代CAR, 并在其中引入"自殺基因"HyTK, 治療兒童復發難治性神經母細胞瘤。在治療的6例患者中, 雖沒有發現與細胞劑量相關的嚴重不良反應, 但每次輸注CAR-T細胞在體內存活時間不超過1周, 并且只有一個瘤荷最小的患者有部分緩解, 治療效果不理想。Lamers等[10]構建scFv(G250)-CD4TM-γ嵌合抗原受體, 通過逆轉錄病毒轉染患者T細胞, 治療CAIX+的三例腎癌患者。雖然IFN-γ在體外分泌增高, 但血漿IFN-γ水平卻與肝毒性反應成正相關, 考慮可能是因為scFv(G250)+ T細胞攻擊正常膽管CAIX+上皮細胞所致。2008年, Pule等[11]用針對GD2靶抗原的CAR治療兒童成神經細胞瘤。輸入6周后, 仍然可以在病人血液內發現EBV特異性的CAR-T細胞, 而非EBV特異性細胞僅維持1周, 接受治療的11個患者中, 6例患者在治療6周后出現腫瘤細胞壞死或腫瘤縮小。此外, 還有以CD20[12]為靶點治療惰性非霍奇金淋巴瘤/套細胞淋巴瘤等應用。雖然第一代CAR-T細胞研究較多, 但是大多數試驗在細胞擴增、體內存活時間、細胞因子分泌等方面還存在不足, 沒有達到預期的臨床效果。

　　1.2 第二代CAR-T細胞

　　研究表明, T細胞的完全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用。其中第一信號為特異性信號, 由TCR識別抗原遞呈細胞表面的抗原肽-MHC復合物所啟動； 第二信號為協同刺激信號, 通過CD28/B7等重要的共刺激分子, 促進IL-2合成, 并使T細胞充分活化及免于凋亡。對于初始型T細胞(未與抗原接觸的T細胞), 如只在信號1而沒有信號2條件下無法使T細胞發揮正常作用； 即使T細胞與抗原接觸, 如果沒有協同刺激信號, 細胞也不能發揮正常功能。相應的, 僅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受體, 如沒有協同刺激信號2, 也無法激活CAR-T細胞。因此, 依照T細胞活化的雙信號學說, 第二和第三代CARs 在嵌合受體上加上如CD28、CD134(OX40)和CD137(4-1BB)等共刺激分子(costimulatory molecule, CM)[13-15], 以提高T細胞的細胞毒性、增殖活性, 維持T細胞應答, 延長T細胞存活時間等(圖2)。其中, CD28分子在調節淋巴細胞增殖和存活方面有著重要作用, 也對效應細胞和記憶細胞的建立起著關鍵作用, 其通過募集如PI3K、Grb2和Lck等分子, 以調節關鍵轉錄因子如NFκB的活性并且增加IL-2和Bcl-xL的分泌。CD134能使初始T細胞獲得持久的體外增殖和較強的IL-2分泌能力。CD137則為維持T細胞應答提供信號, 在T細胞生存和CD8+ T細胞記憶中起關鍵作用[16-18]。

　　Porter等[19]和Kalos等[20]研究用第二代CAR-T細胞(scFvCD19-CD137-CD3ζ)靶向治療3例慢性淋巴細胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL), 接受治療的3例患者回輸CAR-T細胞總數為1.4×107 ~1.1×109, CAR-T細胞不僅在體內擴增1 000倍以上, 而且在血液和骨髓中存活的時間也超過6個月, 分泌的細胞因子如干擾素-γ、CXCL9等較治療前顯著增高。雖然其中1例患者發生了疑似效應細胞脫靶有關的腫瘤溶解綜合征, 但經過對癥處理, 不良反應已經好轉。接受治療的3例患者中, 2例達到完全緩解, 1例部分緩解, 療效得到肯定。Kandalaft等[21]比較一代和二代治療卵巢癌的療效, 證實第二代的CAR-T細胞(MOv19-BBζ)在殺瘤活性和體內存活時間均優于第一代(MOv19-ζ)。2013年, Brentjens等[22]用CD19-CAR(scFvCD19-CD28-CD3ζ)T細胞治療5例形態學或微小殘留病變陽性的急性B細胞白血病(acute B lymphocytic leukemia, B-ALL)患者。通過治療, 5例腫瘤迅速減小, 且微小殘留病灶完全緩解。其中1例患者治療8天之后就很快得到完全緩解, 3例患者緩解期已長達5月至24個月。雖然患者對該療法能夠耐受, 但是也出現了細胞因子相關的毒性反應, 并且與腫瘤負荷成正相關。這也是首次發表的CAR-T細胞治療對成人ALL患者有效的研究。

　　1.3 第三代CAR-T細胞

　　Till等[23]以逆轉錄病毒為載體構建第三代CAR-T細胞(scFv CD20-CD28-CD137-CD3ζ), 治療3例非霍奇金淋巴瘤。經PCR檢測, 效應細胞在體內存活的時間超過12個月。臨床反應持續完全緩解2例, 部分緩解1例。其中1例28歲利妥昔單抗難治性濾泡性淋巴瘤患者, CAR-T細胞治療3.5月后, 頸部淋巴結在1~2周內迅速減小3 cm。

　　而美國國家癌癥研究所Morgan等[24]報道一例結腸癌合并肝和肺轉移患者接受第三代HER2-CAR-T細胞治療。該患者輸注后4小時血液就檢測出有高水平的IFN-γ、GM-CSF、TNF-α和IL-6等細胞因子。因為細胞靜脈輸注后首先經過肺循環, 輸注大量的HER2-CAR+ T細胞后, 識別并攻擊表達HER2的正常肺細胞, 釋放的過量細胞因子, 引起"細胞因子風暴", 患者于治療后5天死亡。這也是迄今為止公布的最為嚴重的1例CAR-T細胞相關的不良反應。由于目前第三代CAR-T細胞臨床應用還比較少, 故其安全性和有效性是否就一定優于第二代CAR-T細胞, 以及選擇怎樣的共刺激分子組合, 還需進一步觀察。

　　2 嵌合抗原受體T細胞基因轉導的方法

　　外源基因進入細胞中通常需要運輸工具, CAR-T細胞基因轉導進入細胞內也不例外。目前, 基因導入的載體主要分為病毒類和非病毒類。

　　病毒載體的轉移效率高, 培養T細胞到達臨床數量的時間相對較短, 且不同病毒載體具有不同表達特點, 故在基礎研究和臨床試驗中應用廣泛, 是目前主要的基因治療載體。《Journal of Gene Medieine》對2008年在臨床基因治療中所用載體的類型進行了調查, 約70%的治療方案采用病毒載體。理論上所有病毒經過刪除與致癌、致毒和復制相關的基因片段并在適當位置插入外源基因, 均可成為基因傳遞的工具。目前最常用的主要是逆轉錄病毒載體(包括慢病毒載體)、腺病毒載體和腺相關病毒載體等。

　　由于病毒載體仍存在著一定的安全隱患, 比如誘導機體產生免疫反應, 存在著插入突變等致瘤及致毒的風險, 且載體容量有限, 制備滴度不高[25-26]等, 而非病毒載體則具有無傳染性、不限制載體容量、化學結構可控、可大量制備及具有靶向性等優點[27], 現已受到越來越多的科研人員的關注。目前, 所應用的非病毒載體有裸DNA、脂質體、多聚物及分子耦聯體等。

　　近年來, 微環DNA被認為是最好的非病毒載體之一, 在基因治療中已被廣為應用。微環DNA是一種新穎的小環超螺旋表達框, 它是傳統質粒在大腸桿菌體內通過位點特異性重組得到的。Chen等[28]通過在體內聯合表達一種限制性內切酶, 將小質粒和親本質粒酶切, 使之成為線性DNA, 這樣就可以通過常規的質粒分離方法獲得高純度的微環DNA。

　　因缺少抗性標記基因、復制原點等細菌序列的特點, 大大增強了這種新穎的小環超螺旋表達框在臨床上的安全性。體外研究也表明, 微環DNA可顯著提高轉基因表達效率[29]。而微環DNA-納米系統, 就是通過保持基本結構不變, 僅改變DNA序列, 便可用來治療不同疾病, 在T細胞基因改造的技術構建中具有深厚的應用潛力(圖3)。

　　3 CAR-T細胞臨床應用中的問題和解決辦法

　　雖然目前CAR-T細胞臨床應用越來越多, 也取得了一定的臨床效果和突破, 但研究者對其安全性還是十分重視和關注的。目前, CAR-T細胞就可能存在如下主要的不良反應。

　　3.1 CAR-T細胞的脫靶效應

　　CAR-T細胞臨床應用的首要問題是脫靶效應, 導致針對正常組織的自身免疫反應。故研究者首先考慮的是腫瘤特異性抗原(tumor specific antigen, TSA)。但目前已知的TSA較少, 除了少數CAR-T試驗針對前列腺特異性膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA)和表皮生長因子受體Ⅲ(epidermal growth-factor receptor variant Ⅲ, EGFRvⅢ)等TSA外[30-31], 大多數針對重要組織不表達或相對可損耗組織表達的腫瘤相關抗原(tumor associated antigen, TAA)。其中, 以針對CD19、CD20和CD22為靶抗原的CAR-T細胞治療B細胞惡性腫瘤研究得最多[19-20,22-23], 原因就是即便損傷了成熟B細胞, 也只是暫時的、可恢復的； 且緩解期血液腫瘤細胞數量級約為108~109, 而1 cm實體腫瘤其腫瘤細胞數就有約1×109。實體瘤腫瘤微環境的免疫抑制作用更強, 免疫細胞不易進入實體瘤內部, 也是CAR-T細胞目前主要治療血液系統疾病的又一重要原因。

　　對于擁有多重胞內信號區的第二和第三代CAR-T細胞, 更強的親和力和信號傳導功能使其結合相關抗原后, 能大量釋放細胞因子, 引起炎癥反應[32], 故選擇合適的靶抗原, 是避免脫靶效應的重要挑戰。上文提到的第一代CAR-T細胞治療轉移性腎細胞癌造成肝細胞毒性和第三代CAR-T細胞的不良反應就是此種情況。此外, Brentjens等[33]報道的1例接受第二代CAR-T細胞的CLL患者, 出現低血壓、呼吸困難和腎衰竭, 于細胞治療后4天死亡, 考慮也是CAR-T細胞相關"細胞因子風暴"所致。

　　最近, Kochenderfer團隊[34]也報告了1例帶CD28和ζ鏈刺激結構域的抗CD19-CAR治療B細胞淋巴瘤患者。病人雖出現CD19+淋巴瘤細胞清除 但是這種效果是通過持續清除外周血B細胞達39周才得以實現的, 說明對健康成熟B細胞的脫靶效應仍然是CAR-T細胞應用于臨床的一個潛在的主要障礙。

　　3.2 插入突變

　　CAR-T技術是在T細胞中插入一段外源DNA片段, 理論上說其結構已被破壞, 存在一定的致瘤風險。雖然目前并沒有關于基因改造T細胞致瘤性的報道, 但是研究者還是一直在關注此問題, 也在不斷通過優化載體類型和轉染方式來降低插入突變的風險。

　　3.3 可能的解決辦法

　　針對以上問題, 如何保證發揮CAR-T細胞生物有效性的同時減少其潛在危險性, 是實現基因聯合細胞治療惡性腫瘤需要解決的問題之一。

　　首先, 很多臨床試驗采用了劑量爬坡的治療方法。在同一代次的治療中, 把細胞劑量由小到大分散到幾次回輸中, 并不斷監測細胞毒性； 或是應用第一或者第二代CAR沒有觀察到毒性后, 再開始下一代CAR-T細胞的治療, 防止可能誘發大規模不良反應。

　　其次, 可以引入自殺基因的人工調控開關, 通過自殺基因系統刪除識別靶抗原的剩余CAR-T細胞。雖然自殺基因在體內需要一些時間才能被激活, 不能阻止急性脫靶毒性引起的組織損傷, 但對于減小長期毒性還是有積極的作用。

　　第三, 可以把CAR中信號結構域分裂到兩個不同CAR(信號一CAR和信號二CAR), 只有當兩個CAR與腫瘤表面的靶抗原都結合以后, 才能完全激活應答。Duong等[35]就發表了類似的方法, 包括使用兩種不同的CAR, 以促進對表達兩種腫瘤抗原的靶細胞更強的應答。

　　第四, 除了激活受體外, 還可以引入抑制性CAR。當CAR-T細胞與正常組織的靶抗原相互作用以后, 抑制性CAR將拮抗效應T細胞的激活。

　　最后, 還可以根據靶抗原表達水平, 微調CAR親和性。以較低的親和性識別抗原高表達的腫瘤細胞, 而不攻擊相同抗原低表達的正常細胞。當然, 這些方法是否可行, 是否適用于不同的腫瘤類型, 還需臨床進一步驗證。

　　4 嵌合抗原受體免疫細胞的發展方向

　　隨著細胞免疫治療腫瘤的進展, 嵌合抗原受體修飾的T細胞在臨床應用中的作用越來越受到人們的重視。通過探索完美的CAR信號組合, 調節適宜的CAR親和性, 增加人工基因調控開關, 產生合理的細胞因子分泌, 誘導T細胞特異性歸巢等, 相信第四代甚至第五代CAR-T細胞也將很快應用于臨床。

　　除此之外, 嵌合抗原受體也不僅僅只是修飾T細胞, 它還可以修飾CIK細胞、NK細胞以及γδT細胞[36-38]等等。例如, 德國波恩大學的研究人員從結直腸癌患者外周血中采集和培養CIK細胞, 并利用CEA+抗體特異性的CAR對CIK細胞進行改造, 使CIK細胞獲得CAR的特性[39]。將CAR-CIK細胞與CEA+腫瘤細胞共培養后, 發現其分泌的IFN-γ, 要高于與CEA-腫瘤細胞共培養情況； 而用未改造的CIK細胞與CEA+/CEA-分別共培養, 卻未觀察到IFN-γ分泌增加, 且CAR-CIK細胞的細胞毒效應也比未改造CIK細胞要高。

　　最后, 當前構建的嵌合抗原受體存在固定的抗原特異性, 這意味著它們每次只能靶向一種類型的腫瘤抗原。將來可以設計構建一種更加通用性的嵌合抗原受體框, 最終可用于同時或依次靶向多種腫瘤抗原[40], 這樣將更大程度解決腫瘤免疫逃逸引起的復發和轉移等問題, 成為療效更確切的過繼性免疫細胞治療方法, 給腫瘤治療帶來新的希望。

　　作者陳杰、王宇環、羅成林、王慧琴、羅曉玲；單位：深圳市合一康生物科技有限公司；發表于《中國細胞生物學學報》2014年36卷第2期）