7、實驗所需器材（但試劑盒不提供）
1）移液器（10；10-100；100-1000μL）
2）軌道搖床（200-900rpm）
3）旋渦混合器
4）帶儲器的8通道移液器
5）洗滌瓶，自動或半自動包被板清洗系統
6）酶標儀
7）雙蒸水或去離子水
8）吸水紙，取樣吸頭，計時器
9）樣品稀釋用試管。
8、手動操作
8.1實驗前說明
注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
注意 | 試劑盒中的質控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL 0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。 |
8.2樣品的稀釋
如果樣品中多巴胺濃度高于最高標準品的應按照下列所述進行稀釋：
樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
血漿 | 多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
尿液 | 多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
8.3樣品、標準品和質控品的提取（提取板）
1） | 將標準品、已稀釋好的質控品、已稀釋好的尿液樣品各20μL和500μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入500μL雙蒸水以消除體積差別。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL酰化試劑，立即混合均勻。 |
9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環境下提取20min。（無需蓋板） |
10） | 快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
14） | 每孔加入300μL Release緩沖液。 |
15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環境下振蕩30min。（無需蓋板） |
已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環境下可存放一夜。
8.4凍干粉或濃縮成分的準備
稀釋 | 成分 | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩定性 | |
25ml | 洗滌液 | 225ml | 雙蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
60μL | 酶聯物 | 6ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1:101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
9、實驗步驟（手動操作）
9.1 COMT酶溶液的準備
注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置 |
在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩定存放1小時。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環境下。COMT溶液可在此環境下穩定存放1-2個月。
9.2樣品、標準品和質控品的酶化
注意 | 如果使用自動置換型移液器，請將取樣吸頭內的殘余液體加回到提取板相應的微孔內。將提取板置于一斜坡位置比較適當。 |
科研用組織勻漿和細胞培養上清可按如下建議處理：細胞培養上清必須根據其培養基及其相應濃度進行處理：根據尿液樣品的操作說明（至少提取20ul上清液），未稀釋樣品的靈敏度大概為1.0ng/ml。如果基質內添加了血清（FCS），血漿（至少提取500ul上清）操作的靈敏度可以是5pg/ml。無高氯酸的組織勻漿可用做勻漿樣品，具體信息請咨詢IBL漢堡公司。
9.3檢測尿液和血漿中的多巴氨
1 | 在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。 |
2 | 在尿液樣品、標準品和質控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質控品和尿液樣品分別10μL加入到相應的微孔中。將100ul提取好的血漿樣品加入到相應的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。 |
3 | 在每一微孔中加入50ul多巴胺抗血清（紫色）。 |
4 | 蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育120min |
5 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
6 | 在每一微孔中加入100ul臨時配置好的酶聯物。 |
7 | 蓋板，在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育60min |
8 | 移去粘性金屬板，棄取孔內反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。吸水紙上拍干以除去殘余液體。 |
9 | 如果可以的話，使用8道移液器加底物液和終止液。加底物液和終止液的時間間隔應當相同，使用自動置換型移液器并避免氣泡產生。 |
10 | 在每一微孔中加入200ul底物液。 |
11 | 在振蕩器（400-600rpm）上室溫（18-25℃）溫育40min |
12 | 在每一微孔中加入50ul PNPP終止液，輕輕振板以使溶液混合均勻。 |
13 | 加終止液后60min內405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm） |
10、自動操作步驟
10.1實驗前說明
注意 | 用于96人份檢測色試劑盒成分可分成兩次進行。下列所述體積為做48人份時所需要的量。 |
注意 | 試劑盒中的質控品和所有尿液樣品在使用前都必須在試管中用0.1M的HCl按1：5的比例進行稀釋（例如：20μL尿液+80μL0.1M的HCl）。標準品無需稀釋。 |
10.2樣品的稀釋
如果樣品中多巴胺濃度高于最高標準品的應按照下列所述進行稀釋：
樣品 | 待稀釋 | 稀釋液 | 備注 |
血漿 | 多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度 | 雙蒸水 | 提取步驟前 |
尿液 | 多巴胺濃度高于最高標準品中多巴胺的濃度 | 0.1N的HCl | 提取步驟前 |
10.3樣品、標準品和質控品的提取（提取板）
1） | 將標準品、已稀釋好的質控品、已稀釋好的尿液樣品各30μL和750μL血漿樣品加入到提取板相應的微孔中。除血漿樣品孔外，在所有的微孔中加入750μL雙蒸水以消除體積差別。 |
2） | 在每一微孔中加入1000μL提取緩沖液 |
3） | 蓋板。在軌道搖床（600-900rpm）上18-25℃的環境下提取30min。在提取過程中，液體的表面應該會浸濕粘性金屬板，但液體的量不能超過微孔的2/3。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
4） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
5） | 每孔加入2ml雙蒸水 |
6） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
7） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
8） | 每孔加入150μL提取緩沖液，再向每孔中加入50μL酰化試劑，立即混合均勻。 |
9） | 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環境下提取20min。（無需蓋板） |
10） | 快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
11） | 每孔加入2ml雙蒸水。 |
12） | 用新的粘性金屬板蓋板。在軌道搖床上（600-900rpm）18-25℃的環境下振蕩5min。液體是否濺出并不會影響實驗結果。 |
13） | 移去粘性金屬板，快速棄取孔內反應液，在吸水紙上拍干。 |
14） | 每孔加入450μL Release緩沖液。 |
15） | 在軌道搖床（400-500rpm）上18-25℃的環境下振蕩30min。（無需蓋板） |
已準備好的樣品應當在當天就進行檢測。如果不行的話，您可將提取板用粘性金屬板蓋好，在2-8℃的環境下可存放一夜。
10.4凍干粉或濃縮成分的準備
稀釋 | 成分 | 稀釋液 | 比例 | 備注 | 貯存 | 穩定性 | |
25ml | 洗滌液 | 450ml | 雙蒸水 | 1:10 | 充分混合 | 2-8℃ | 4W |
150μL | 酶聯物 | 15ml | 洗滌緩沖液（已稀釋好） | 1:101 | 臨時配置，僅能使用一次，混合時避免氣泡產生 | 18-25℃ | 5h |
4 | PNPP底物片 | 10.7ml | PNPP底物液 | 臨時配置，僅能使用一次 | 18-25℃ | 5h |
11、實驗步驟（自動操作）
11.1 COMT酶溶液的準備
注意：COMT酶溶液應在使用前直接臨時配置 |
在COMT凍干粉中加入1.25ml雙蒸水，充分混和。再加入1.25ml酶聯溶液，然后再加入1.25ml酶溶液和0.40ml COMT添加劑以充分混合溶解的COMT試劑*，COMT酶溶液最后的體積為每支4.15ml。一支可做48人份。溶液可用旋渦混合器混合，但要避免氣泡產生，配置好的COMT溶液可在室溫下穩定存放1小時。 |
*如果只需要一定量的COMT溶液，則剩余的COMT溶液應立即凍存于-20℃的環境下。COMT溶液可在此環境下穩定存放1-2個月。
11.2實驗步驟
在使用自動方法做實驗時，我們建議按1：10的比例預先稀釋提取好的標準品、質控品和尿液樣品（如果是手動操作則用Release緩沖液進行稀釋）。如果稀釋了，第二個步驟可簡化為：將已提取好的血漿樣品、已提取好的標準品（按1：10的比例預先稀釋）、質控品和尿液樣品各100μL加入到微孔中。在進行預稀釋時，應當考慮到自動操作的死容積。
1） 在包被板的每一微孔中加入75μL剛配置好的COMT酶溶液，輕輕振蕩。
2） 在尿液樣品、標準品和質控品的微孔中加入90μL Release緩沖液（血漿樣品孔除外）。將已提取好的標準品、質控品和尿液樣品分別10μL加入到相應的微孔中。在此加樣步驟中，可直接將取樣吸頭伸入到COMT溶液中。溶液顏色變成粉色，輕輕振蕩。
3） 每孔中加入50μL多巴胺抗血清。
4） 蓋板。在振蕩器（400-600rpm）上18-25℃的環境下溫育120min
5） 棄取孔內反應液，每孔用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
6） 每孔加入100μL酶聯物
7） 蓋板。在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環境下溫育60min
8） 棄取孔內反應液，用250-300μL已稀釋好的洗滌液洗板6次。
9） 加底物液和終止液時，其時間間隔應相同
10） 每孔加入200μL底物液
11） 在軌道搖床（400-600rpm）上18-25℃的環境下溫育40min。如果自動操作時的溫度超過25℃時，則應相應的將溫育時間縮短至30min。
12） 每孔加入50μL PNPP終止液以終止底物反應，輕輕振蕩包被板以充分混合試劑成分。
13） 加終止液后60min之內405nm處讀取OD值。（參考波長：620-650nm）
12、期望值
實驗結果不能當作判斷任何治療結果的唯一因素，疾病的判斷還應當與其它臨床觀察和診斷檢測相結合。以下結果為正常人群的正常值（5%-95%），建議每個實驗室讀確定自己的正常值范圍：
尿液 | 血漿 | |||
μg/d | nmol/d | pg/mL | nmol/L | |
多巴胺 | ＜600 | ＜3917 | ＜100 | ＜0.65 |
本譯文僅供參考，詳情請以原文為準。
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