微生物分離純化實驗

實驗方法原理

該方法操作簡便，普通用于微生物的分離與純化。

其基本原理包括兩方面：

1. 選擇適合于待分離微生物的生長條件，如營養、酸堿度、濕度和氧等要求或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環境，從面淘汰一些不需要的微生物。

2. 微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落可以是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等技術完成。

實驗材料 米曲霉土樣

試劑、試劑盒 10％ 酚無菌水 鏈霉素

儀器、耗材 肉膏蛋白胨瓊脂培養基淀粉瓊脂培養基（高氏 I 號）馬丁氏瓊脂培養基無菌玻璃涂棒試管無菌三角瓶玻璃珠無菌吸管接種環無菌培養皿顯微鏡記號筆

實驗步驟

1. 倒平板

將肉膏蛋白胨瓊脂培養基、高氏 I 號瓊脂培養基、馬丁氏瓊脂培養基加熱溶化，待冷至 55～60℃ 時，高氏 I 號瓊脂培養基中加入 10％ 酚數滴，馬丁氏培養中加入鏈霉素溶液（終濃度為30 μg/ml），混均勻后分別倒平板，每種培養基倒三皿。

倒平板的方法：右手持盛培養基的試管或三角瓶置火焰旁邊，用左手將試管塞或瓶塞輕輕地拔出，試管或瓶口保持對著火焰i然后用右手手撐邊緣或小指與無名指夾住管（瓶）塞（也可將試管塞或瓶塞放在左手邊緣或小指與無名指之間夾住。如果試管內或三角瓶內的培養基一次用完，管塞或瓶塞則不必夾在手中）。左手拿培養皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養基約 15 ml（圖 VII-1），加蓋后輕輕搖動培養皿，使培養基均勻分布在培養皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即為平板。

2. 制備土壤稀釋液

稱取土樣 10 g，放入盛 90 ml 無菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖約 20 min，使土樣與水充分混合，將細胞分散。用一支 1 ml 無菌吸管從中吸取 1 ml 土壤懸液加入盛有 9 ml 無菌水的大試管中充分混勻，然后用無菌吸管從此試管中吸取 1 ml（無菌操作見圖VII-2）加入另一盛有 9 ml 無菌水的試管中，混合均勻，以此類推制成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 不同稀釋度的土壤溶液，如圖VII-3，A所示.

3. 涂布

將上述每種培養基的三個平板底面分別用記號筆寫上 10-4、10-5 和 10-6 三種稀釋度，然后用無菌吸管分別由10-4、10-5 和 10-6 三管室溫下靜置 5～10 min，使菌液吸附進培養基。

平板涂布方法：將 0.1 ml 菌懸液小心地濟在平板培養基表面中央位置（0.1 ml 的菌液要全部滴在培養基上，若吸移管尖端有剩余的，需將吸移管在培養基表面上輕輕地按一下便可）。右手拿無菌涂棒平放在平板培養基表面上，將菌懸液先沿一條直線輕輕地來回推動，使之分布均勻玻璃涂棒（見圖 VII-4），然后改變方向沿另一垂直線來回推動，平板內邊緣處可改變方向用涂棒再涂布幾次。

4. 培養

將高氏 I 號培養基平板和馬丁氏培養基平板倒董于 28℃ 溫室中培養 3～5 d，肉膏蛋白胨平板倒置于 37℃ 溫室中培養 2～3 d。

5. 挑菌落將培養后長出的單個菌落分別挑取少許細胞接種到上述三種培養基的斜面上（圖 VII-3，C），分別置 28℃ 和 37℃ 溫室培養，待菌苔長出后，檢査其特征是否一致，同時將細胞涂片染色后用顯微鏡檢査是否為單一的微生物，若發現有雜菌，需再一次進行分離、純化，直到獲得純培養。

注意事項

值得指出的是從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特征外還要結合顯微鏡檢測個體形態待征后才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列的分離與純化過程和多種特征鑒定方能得到。